Les techniques de la culture in vitro

L’utilisation d’un fragment de plante pour reproduire un individu comme dans le bouturage, ou pour l’associer à une autre plante, comme dans la greffe, fait partie des biotechnologies anciennes. De nos jours il existe des techniques qui sont des méthodes plus fines, partant de fragments de plus en plus réduits, jusqu’à la cellule isolée.
Les applications sont nombreuses aujourd’hui tant dans le domaine de l’horticulture, de la recherche, notamment en amélioration des plantes, pour conserver la diversité variétale ou sauvegarder des espèces menacées.

1- Culture de méristèmes.

Les méristèmes sont des zones de cellules à division intenses, situés au cœur des bourgeons et des extrémités des racine. (Auge et al., 1989).
L’apex caulinaire présente des territoires caractérisés par différentes activités mitotiques, différents plans de division et d’organisation des cellules.
La structure du méristème caulinaire de l’olivier (Olea europea Var. Chemlal) a été examinée par Yakoub-Bougdal (2005) par l’intermédiaire de coupes cytologiques :
Où l’on distingue :

• La zone axiale (ZA) : C’est une zone peu active à capacité histogène, elle occupe le sommet du méristème, et est très pauvre en
• Le méristème médullaire ou zone centrale (ZM) : Les divisions transversales assurent la croissance en longueur de la tige, région d’élongation, sa moelle est entourée de bases foliaires et de faisceaux libéro-ligneux.
• L’anneau initial ou zone périphérique : Les cellules typiquement méristématiques ont une intense activité mitotique, il se présente sous forme d’un manchon cylindrique. A ce niveau, apparaissent les primordiums foliaires, la partie inférieure édifie les soubassements

L’organisation de l’apex caulinaire est aussi classiquement décrite en terme de tunica et de corpus.
La tunica est généralement constituée de deux couches cellulaires (T₁, T₂) sur les  bords de l’aire apicale, il édifie les feuilles et tous les tissus de la tige.
Le corpus, est un massif cellulaire situé à la base de la région axiale, qui édifie la moelle.
La figure 12, nous montre la zonation des méristèmes caulinaires issus des bourgeons terminaux, d’après Yakoub-Bougdal (2005).
Sur les deux flancs de l’anneau initial, il y a de nombreuses mitoses. Les divisions dans ce massif cellulaire se font dans tous les sens. Cette intense prolifération est liée au fait que le méristème primaire exerce une dominance sur la prolifération des axillaires.
La figure 13, nous montre la zonation des méristèmes caulinaires issus des bourgeons axillaires.
Les divisions mitotiques se font au niveau des deux bandes latérales de l’anneau initial.

1. L’étude du fonctionnement du méristème.
2. La propagation végétative avec un taux de multiplication élevé et le risque d’obtention de variants est réduit.
3. La reconstitution de clones indemnes de virus ou de mycoplasmes à partir de plants mères infestés. (Margara, 1989). (objectif de notre travail).

2- La micropropagation

Elle consiste à reproduire des plantes semblables à la plante-mère, c’est le clonage végétal (Auge et al., 1989).
Le principe consiste à prélever sur la plante un organe ou un explant, à le cultiver en conditions aseptiques sur un premier milieu, puis le repiquer sur un deuxième milieu dont le rôle est de provoquer soit le développement de bourgeons pré-existants, soit la néoformation de bourgeons ou d’embryons somatiques, qui, une fois repiqués, pourront donner une plante (Auge et al., 1989).

3- Embryogenèse somatique

C’est l’obtention d’embryons à partir des cellules non zygotiques.
Les embryons somatiques sont morphologiquement et anatomiquement similaires aux embryons zygotiques ; ils se développent à partir d’une seule ou d’un amas de cellules et présentent une bipolarité dès les premières divisions (Marquis, 1998).
D’après Auge et al. (1989), deux étapes importantes pour l’induction, l’entretien et la germination des embryons :

1. Un cal est initié sur un milieu d’induction, riche en auxine et en azote. Ce cal est fragmenté et repiqué sur le même milieu pendant plusieurs cycles.
2. Les cals sont transférés sur un deuxième milieu pauvre ou sans auxine, les embryons s’y développent.

Les résultats obtenus chez l’olivier jusqu’à présent laissent présager un avenir prometteur  pour  certains  cultivars,  notamment  ‘ Dolce  agogia ‘,  ‘ Leccino ‘,  ‘ Frantoio ‘  et ‘ Moraiolo ‘ (Rugini, 1988), ‘ Canino ‘ (Lambardi et al., 1995 ; Rugini et al., 1995) et chez l’olivier sauvage var. ‘ sylvestris ‘ (Orinos et al., 1991). Cependant, il reste à développer certains aspects, en particulier les besoins nutritifs et hormonaux de l’embryon, de même que les conditions de survie et de développement des plantules issues de ces embryons (Brahadda et al., 2008)

4- Haplodiploïdisation

L’utilisation des plantes haploïdes en amélioration des plantes, présente des avantages considérables se traduisant, pour les plus importants, par des gains de temps et une meilleure efficacité de sélection. Cette technique est la plus performante pour obtenir des plantes totalement homozygotes et, par conséquent, constituer des races pures.
Il existe deux voies de réalisation, la voie mâle ou androgenèse et la voie femelle ou gynogenèse.

5- Création de variabilité

Les mutations conduisent à la création d’un nombre croissant de nouvelles variétés.
Ces mutations peuvent être induites par le biais de diverses techniques :

• Les radiations
• La variation somaclonale ou les vitrovariants

6- Les protoplastes

Le terme protoplaste désigne une cellule végétale débarrassée de sa paroi : elle apparaît alors sous forme d’une cellule sphérique, limitée par sa membrane plasmique. L’intérêt de ces cellules réside dans le fait qu’il est possible de faire introduire dans la cellule des molécules diverses dont l’ADN, des organites, des noyaux (fusion) et effectuer des manipulations génétiques (Auge et al., 1989).
Cependant, le développement d’un protocole efficace de fusion de protoplastes nécessite la réalisation d’un certain nombre d’étapes pouvant chacune constituer une barrière (El Hamdouni et al., 1999) :

• Choix de la source des explants et du
• Développement d’un système enzymatique efficace pour se débarrasser de la paroi pectocellulosique.
• Développement d’un milieu approprié pour la survie des
• Exécution du protocole de fusion pour la production d’hybrides
• Sélection du produit de
• Développement d’un milieu permettant la régénération de la paroi des cellules sélectionnées et éventuellement de plantes complètes.

Source:

Tabti, Dalila 2010. Regénération in vitro de plants sains à partir d’Apex caulinaires d’olivier Olea europea L. var. Chemlal.

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