Production végétale - cours

Techniques de réalisation des cultures in vitro

Techniques de réalisation des cultures in vitro

1. Conditions d’asepsie

La première condition de la réussite d’une culture est l’asepsie. En effet, les milieux de culture sont très favorables au développement des bactéries et des champignons dont la croissance aboutit à l’envahissement de la culture (Margara, 1984).

2- Milieux de culture

Le milieu de culture est constitué principalement d’eau, de sels minéraux (macro et micro- éléments, fer), d’éléments organiques (vitamines, sucre, parfois des acides aminés), et de phytohormones. Cette solution aqueuse est solidifiée avec de l’agar agar.

3- Composition chimique

Les sels minéraux

Parmi les éléments nécessaires à la vie de la plante on distingue généralement les macro et les micro-éléments

Les macro-éléments

Il s’agit des 6 éléments indispensables : l’azote (N), le phosphore (P), le soufre (S), qui sont des constituants fondamentaux des tissus végétaux (protéines, acides nucléiques…).Le potassium (k), le magnésium (Mg), et le calcium (Ca) interviennent en particulier dans le maintien de l’équilibre entre cations et anions dans la plante (Margara, 1984).

Les micro-éléments

Ils jouent un rôle essentiel dans les mécanismes enzymatiques comme activateurs ou constituants des coenzymes. Les principaux d’entre eux sont : le cuivre (Cu), le zinc (Zn), le manganèse (Mn), le molybdène (Mo) et le bore (B) (Margara, 1984). Le fer (Fe) est ajouté en présence d’un chélateur, l’acide éthylène di-amine tétraacétique (E. D. T. A.).

4- Les substances organiques

Les sucres

Les tissus en culture in vitro sont largement hétérotrophes au carbone en raison de l’absence ou de l’insuffisance de l’assimilation chlorophyllienne. Il est donc généralement indispensable d’ajouter des glucides au milieu de culture. Les deux sucres les plus utilisés sont le saccharose et le glucose (Margara, 1984).
Dans notre essai, nous avons utilisé du saccharose à une concentration de 30g/l.

Les vitamines

Elles favorisent l’organogenèse. L’acide aminé le plus couramment utilisé est la glycine (C2H5O2) notamment retrouvé dans les composants organiques du milieu MS.

 La gélose (l’agar-agar)

C’est un polyoside (glucide) de haut poids moléculaire, qui est extrait des algues du genre Gelidium (Auge et al., 1989).
Elle permet l’obtention d’un milieu solide dans lequel les explants peuvent être repiqués. Elle a l’avantage de retenir très peu d’ions, mais en contre partie elle fournit un milieu de vie pauvre en oxygène lorsqu’elle est utilisée à une forte concentration.
La concentration d’agar variera avec le type d’organe cultivé, la qualité de l’agar et le pH du milieu. Généralement, plus le pH est bas, plus l’agar tend à devenir liquide (Auge et al., 1989).

Le charbon actif

Selon Hamlat (1995), le charbon actif absorbe les phénols, les produits de leur oxydation, accélère la croissance des cultures et favorise l’enracinement.
Dans d’autres cas, il possède un effet inhibiteur sur l’effet des auxines et les cytokinines contenus dans le milieu (Margara, 1984).

5- Les régulateurs de croissance (Phytohormones)

Selon Ross (1969) et Salisbury (1994) in Meyer et al., 2004, une phytohormone est une substance organique végétale qui régule la croissance et le développement. Ces régulateurs de croissance appartiennent à cinq grands groupes :

Les auxines

Les auxines agissent sur l’élongation cellulaire et inhibent la croissance des racines en induisant la formation d’éthylène dans ces organes. Elles sont, par ailleurs, impliquées dans les de phénomènes physiologiques : tropisme, dominance apicale, division et différenciation cellulaire, abscission, développement du péricarpe des fruits charnus et la différenciation d’organes (Mazliak, 1999).
Selon Auge et al, 1989, on a :

  • L’acide indole -3- acétique (AIA) : C’est une auxine naturelle pouvant être obtenue par synthèse chimique. Elle se dégrade rapidement à la lumière.
  • L’acide α-naphtalène – acétique (ANA) : Produit de synthèse, stable en milieu aqueux et à la chaleur.
  • 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D) : C’est un herbicide de synthèse à effet auxinique très puissant, presque insoluble dans l’eau. Elle devient toxique à une concentration élevée, en provoquant la réaction hyperhydrique des tissus (Margara, 1984).
  • Acide indole – butyrique (AIB) : C’est une substance de synthèse relativement stable.

Les cytokinines (CKs)

Elles sont utilisées pour stimuler la prolifération des tissus en culture. A une forte concentration elles déclenchent la néoformation de bourgeons sur cals et favorise la prolifération des méristèmes axillaires en culture d’apex (Margara, 1984).

  • Zéatine : Cytokinine naturelle, stable en milieu aqueux et à la chaleur.
  • 2-isopentényladénine (2 ip) : Cytokinine naturelle.
  • Benzylaminopurine ou 6-benzyladénine (BAP ou BA) Cytokinine de synthèse.
  • Kinétine ou 6-furfurylaminopurine (KIN, KN) : Cytokinine de synthèse stable à la chaleur.

Le schéma suivant représente les niveaux relatifs d’une auxine et d’une cytokinine nécessaires pour obtenir différentes réponses morphogénétiques.

Fig.11: Effets organogènes des régulateurs de croissance in vitro.
Fig.11: Effets organogènes des régulateurs de croissance in vitro.

Le comportement physiologique d’un explant mis en culture serait le suivant d’après  Auge et al., 1989.

  • Si le rapport auxine/cytokinine est élevé, on obtiendra un fonctionnement de type rhizogène ;
  • Si ce rapport est faible, l’explant évoluera vers un fonctionnement caulogène ;
  • Si le rapport est voisin de l’unité, on aura un comportement callogène.

Les gibberellines (GAs)

Selon Auge et al., 1989, les premières observations (1926) ont été faites sur des plants de riz attaqués par un champignon (Gibberella) ; les tiges avaient des entre-nœuds beaucoup plus allongés et les feuilles étaient chlorotiques. Des extraits aqueux du champignon provoquaient les mêmes symptômes, d’où l’idée de l’existence d’une substance responsable de ces effets.
La première gibbérelline identifiée est l’acide gibbérellique GA3, c’est un produit naturel, qui se dégrade rapidement en solution aqueuse.
Les gibbérellines favorisent l’allongement des entre-nœuds de tige, lèvent la dormance des graines.

 Acide abscissique (ABA)

C’est un inhibiteur naturel très répandu dans les plantes, il favorise l’abscission des feuilles et des fruits et exerce une inhibition de la croissance (Heller, 1995).
Il a aussi une action sur la perméabilité cellulaire aux ions potassium ; par cette action il provoque la fermeture des stomates (Auge et al., 1989).

 L’éthylène CH2 = CH2

Il est produit à partir de la méthionine dans les tissus sénescents ou soumis à un stress (Meyer et al., 2004).
L’éthylène est un composé gazeux identifié dans les enceintes de stockage des fruits, les principales propriétés de ce régulateur selon Auge et al., 1989 sont :

  • Déclenchement du processus de maturation des
  • Accélération du processus d’abscission des feuilles et des
  • Induction de la

D’autres phytohormones ont été récemment découvertes. Certaines sont impliquées dans la morphogenèse, d’autres dans la défense contre les agents pathogènes : (Meyer et al., 2004).

Polyamines (PA)

Toutes les cellules contiennent des polyamines comme la putrescine (Put) (H2N (CH2)4 NH2) et la spermine (Spm) (H2N (CH2)3 NH (CH2)4 NH (CH2)3 NH2. Les cellules eucaryotes contiennent la spermine (Spm). Les polyamines ont un effet antisénescence. Elles affectent la division cellulaire, la différenciation vasculaire, la formation d’embryoîdes,
l’initiation des racines, de tiges adventives et de fleurs, le mûrissement et la sénescence des fruits. Elles agissent à des concentrations plus élevées par rapport aux régulateurs de croissance traditionnels.

Acide jasmonique (JA)

L’acide jasmonique contrôle la réaction aux blessures et l’expression des gènes des PR (pathogenesis related proteins) impliqués dans la défense de la plante. L’ABA et la JA inhibent la croissance, la germination et induisent la sénescence.

Acide salicylique (SA)

L’isolement de cet acide chez le Saule date du XIXè Siècle. La synthèse du dérivé acétylé, l’aspirine, est à l’origine de nombreuses applications thérapeutiques. Il fait partie des composés phénoliques, supposés comme étant des métabolites secondaires, non essentiels, alors qu’ils jouent un rôle clé chez les plantes. Ils interviennent dans la synthèse de la lignine, composant structural important des parois. Les phytoalexines contribuent à la défense des plantes contre les microbes, les insectes et les herbivores.

Brassinolides (BR)

C’est la première hormone stéroïde découverte chez les végétaux. Il existe une trentaine de brassinostéroides (BR) dans les différentes parties des plantes, chez les monocotylédones, les dicotylédones, les conifères et les algues. Dans les tests biologiques, ils miment l’effet de l’AIA, de GAs, ou des CKs. Ils peuvent aussi avoir une réponse différente. Les GAs et les CKs retardent la sénescence des feuilles, les BR l’accélèrent. Ils stimulent l’élongation des tiges et inhibent celle des racines. Ils contrôlent la photomorphogénèse.

Source:

Tabti, Dalila 2010. Regénération in vitro de plants sains à partir d’Apex caulinaires d’olivier Olea europea L. var. Chemlal.

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