LES PRINCIPAUX ENZYMES COAGULANTS DU LAIT

LES PRINCIPAUX ENZYMES COAGULANTS DU LAIT
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1. Protéases dorigine animale (protéases gastriques)

Les enzymes coagulants d’origine animale sont des protéases gastriques. Les plus employés sont la présure (constitué principalement de chymosine), les pepsines; bovine, porcine et de poulet. Ces protéases sont formées à partir d’un précurseur (zymogène), forme inactive, secrété par la muqueuse gastrique. Le tableau 3 donne la composition en acide aminés des ces protéases et celle des zymogènes correspondants. Le zymogène de la pepsine est appelé pepsinogène alors que celui de la chymosine est appelé prochymosine. Comparé à l’enzyme actif, le zymogène possède un segment peptidique supplémentaire liée de la partie N-terminal de l’enzyme actif. Au niveau de la structure tridimensionnelle, cette chaîne peptidique, souvent nommée prosegment, occupe le site actif et sert à bloquer l’entrée du substrat. Ainsi l’activation du proenzyme nécessite la libération du prosegment et la dissociation de ce dernier du site actif (RICHTER et al., 1998).

Les zymogènes gastriques, stables à pH neutre, sont convertis en enzyme actif sous l’effet de l’acidité naturelle du milieu stomacal. La conversion à lieu à des pH inférieur à 5.

Cette dépendance du pH de l’activation est due à la présence d’interactions électrostatiques entre les résidus basiques dans le prosegment et les résidus acides de la portion correspondante à l’enzyme actif. Ces interactions jouent un rôle essentiel dans le maintien du zymogène sous une forme inactive en stabilisant la position du prosegment dans le site actif (SANNY, et al., 1975 ; RICHTER et al., 1998). Aux valeurs de pH inférieurs à 5,0 les résidus acides impliqués deviennent protoné ; ce qui entraîne la rupture des interactions électrostatiques entre le prosegment et l’enzyme actif. Dès qu’une très faible quantité d‘enzyme est libérée du précurseur à la faveur de l’acidité stomacale, la réaction devient autocatalytique, l’enzyme produit provoque l’activation du zymogène par libération du prosegment. Cette opération est réalisée par voie directe ou séquentielle. Par voie directe, le prosegment est éliminé en une seule étape par clivage de la liaison peptidique entre la partie C-terminal du prosegment et la partie N-terminale de l’enzyme actif. Cette voie a été mise en évidence pour le pepsinogène de poulet et pour le pepsinogène de singe (BOHAK, 1969 ; GREEN et LLEWELLIN, 1973 ; KAYAGEMA et TAKAHASHI, 1976). Par voie séquentielle, plusieurs liaisons peptidiques sont préalablement attaquées dans le prosegment.

Le pepsinogène bovin est activé selon cette voie (HORBOE et a.l, 1974). Toutefois, l’activation du zymogène peut avoir lieu selon les deux voies simultanément, c’est le cas du pepsinogène de porc (KOGA et HAYASHI, 1976). Dans le cas du prochymosine bovin l’activation à pH 2,0 donne des produits intermédiaires hautement stables et dont la conversion en enzyme actif n’a lieu que lorsque le pH est élevé à 5,5 (FOLTMANN, 1971 ; RICHTER et al., 1998).

Tableau 3 : Composition en acides aminés des enzymes gastriques et des pro-enzymes correspondants (CHOW et KASSELL, 1968 ; BOHAK, 1969 ; FOLTMAN, 1971 ; SEPULVEDA et al., 1975 KAGEYAMA et TAKAHASHI, 1976).

Tableau 3 : Composition en acides aminés des enzymes gastriques et des pro-enzymes correspondants (CHOW et KASSELL, 1968 ; BOHAK, 1969 ; FOLTMAN, 1971 ; SEPULVEDA et al., 1975 KAGEYAMA et TAKAHASHI, 1976).

1-1. La présure

La présure de veau est l’agent coagulant traditionnellement utilisé pour la coagulation du lait en vue de la fabrication de la majorité des fromages ; de petites quantités sont produites à partir de l’estomac de chevreau et d’agneau. Selon la fédération internationale du lait (FIL) la dénomination «présure» est donnée à l’extrait coagulant provenant de caillettes de jeunes ruminants abattus avant sevrage (ANDREN, 2002). Elle contient en réalité deux fractions actives, l’une, majeure, constituée par la chymosine, l’autre, mineure, par la pepsine. Au pH du lait (6,2-6,6), la chymosine représente plus de 80 % de l’activité coagulante (ANDREN, 2002). La sécrétion de chymosine s’arrête au moment du sevrage lorsque des aliments solides sont présents dans la ration alimentaire, la production de pepsine s’accroît alors très fortement est devient dominante.

L’obtention de présure à partir de veaux fistulés à fait l’objet de plusieurs expériences.

La collecte de présure, deux fois par jour, jusqu’à ce que les veaux atteignaient trois à quatre mois, a permis l’obtention d’une quantité de présure 30 à 40 fois plus importante que celle obtenue par veau après abattage (ALAIS, 1974 ; ERNESTROM et WONGT, 1983).

Toutefois, le coût opératoire et les risques cliniques ont limité le développement de ce procédé.

L’obtention de chymosine par transgénèse connaît actuellement un grand développement, vu le rendement élevé et la qualité de produit obtenue qui est comparable à celle de la chymosine de veau (BARBANO et RASMUSSEN, 1992 ; YAMASHITA et al.
1994 ; BELDARRAIN et al., 2002).

La chymosine est extraite des caillettes de veaux sous sa forme inactive. Le prochymosine est ensuite activé par une protéolyse limitée. Cette action est accompagnée par une réduction du poids moléculaire de 36000 à 31000 (FOLTMANN, 1971).

Les différentes fractions de la chymosine, désignées par A, B et C, sont toutes actives avec chacune une activité coagulante relative spécifique de 125, 100 et 55-60, respectivement.

La chymosine B est la plus abondante. Aucune différence entre la chymosine A et B n’a été relevée ; cependant, la chymosine C représentait un mélange contenant des produits de dégradation (FOLTMANN, 1971). Il existe deux variants génétiques de la chymosine, A et B, qui se distinguent par la présence, dans la position 244, de l’acide aspartique pour le variant A et de la glycine pour le variant B. Les deux variants sont présents avec un taux de 50% dans la population bovine. Bien que la chymosine A possède une activité coagulante 25% supérieure à celle de la chymosine B, les deux variants possèdent des propriétés fromagères similaires (ANDREN, 2002).

Le pH optimum d’activité protéolytique de la chymosine est au environ de 4,0 (FOLTMANN, 1971). La chymosine possède une activité coagulante élevée (à pH 6,7) comparée à la pepsine. L’activité coagulante de 1 mg de chymosine correspond à celle de 5 mg de pepsine à pH 6,7 (ENDREN, 2002). L’activité maximale de la chymosine se situe à pH 5,5 et à la température de 42°C (RAMET, 1997) (tableau 4). La chymosine hydrolyse la caséine en milieu de chaîne est possède une double activité, une sur la caséine ĸ qui conduit à la déstabilisation micellaire au cours de la phase de coagulation et une activité faible de protéolyse générale sur les différentes fractions caséiniques, qui intervient essentiellement pendant l’affinage du fromage (O’KEEFFE et al, 1976 ; DAVE et al., 2003).

Tableau 4 : Caractéristiques des enzymes gastriques (CHOW et KASSELL, 1968 ; BOHAK, 1969 ; FOLTMAN, 1971 ; ANTONINI et RIBADEAU-DUMAS, 1971 ; ERNSTROM et WONGT, 1983 ; CUVELLIER, 1993).

Tableau 4 : Caractéristiques des enzymes gastriques (CHOW et KASSELL, 1968 ; BOHAK, 1969 ; FOLTMAN, 1971 ; ANTONINI et RIBADEAU-DUMAS, 1971 ; ERNSTROM et WONGT, 1983 ; CUVELLIER, 1993).

(a ) valeurs déterminées sur l’hémoglobine comme substrat, (b) valeurs déterminées sur le lait comme substrat

1-2. La pepsine

La pepsine est une protéase acide présente dans le suc gastrique de tous les
mammifères et les oiseaux. L’une de ses remarquables caractéristiques est sa grande activité
dans cet environnement acide ; elle est active même à pH 1 où plusieurs enzymes et protéines
subissent une rapide dénaturation.

1-2-1. La pepsine bovine

La pepsine bovine est extraite à partir des caillettes d’animaux adultes et de veaux sevrés. L’extrait brut contient un pepsinigène majoritaire et plusieurs pepsinogènes mineurs qui donnent après activation à pH 2,0 la série de pepsines correspondant (CHOW et KASSELL, 1968). ANTONINI et RIBADEAU-DUMAS (1971) ont pu révéler la présence d’une pepsine I et d’une pepsine II dans l’extrait activé de caillette de bœuf, issus de deux zymogènes différents. La pepsine I est un constituant mineur (ANTONINI et RIBADEAU-DUMAS, 1971). Les propriétés protéolytiques de la pepsine bovine sur les caséines sont plus semblables à celles de la chymosine (ERNSTROM et WONG, 1983 ; BARBANO et RASMUSSEN, 1992). En outre, son activité coagulante est moins dépendante du pH, contrairement à la pepsine porcine et elle provoque la coagulation du lait à pH 6,9 (ERNSTROM et WONG, 1983). Le Tableau 4 donne quelques caractéristiques de la pepsine bovine.

1-2-2. La pepsine porcine

La pepsine porcine est produite à partir de la muqueuse gastrique du porc sous sa forme inactive. L’extrait brut de la pepsine contient dans la majorité de la pepsine A et des composes mineurs correspondants aux pepsines B, C, D, et à la gastricsine (CUVELLIER, 1993). Les pepsines sont produites à partir de zymogènes différents. La pepsine B et C provoquent la coagulation du lait mais beaucoup moins rapidement que la pepsine A, majoritaire.

Cependant, contrairement à la pepsine porcine A, elles sont relativement stables au pH 6,9. La pepsine D est très instable aux pH supérieurs à 6,0 et elle est deux fois plus active que la pepsine majoritaire dans la coagulation du lait (ERNSTROM et WONGT, 1983). La pepsine porcine est formée d’une seule chaîne polypeptidique composée de 321 résidus d’acides aminés est son poids moléculaire est de 35000 Da. (Tableau 4) (SEPULVEDA et al., 1975 ; KAGEYAMA et TAKAHASHI, 1976). Son activité catalytique est la plus élevée entre pH 1 et 4 avec un maximum vers 1,8 et varie selon la nature du substrat (BOHAK, 1969 ; ANTONINI et RIBADEAU-DUMAS, 1971).

Le principal inconvénient de la pepsine porcine comme agent coagulant du lait est le fait que son activité coagulante est fortement dépendante du pH. Aux valeurs de pH voisin de 6,5 et de température voisine de 30 °C, utilisées en fromagerie, la pepsine porcine est partiellement dénaturée et après 1 heure, seulement 50% de son activité coagulante est maintenue (ANDREN, 2002).

1-2-3. La pepsine de poulet

Le pepsinogène de poulet et la pepsine correspondante ont été partiellement purifiés par HERRIOT, BARTZ et NORTHOP (1938). Ces auteurs ont observé que la pepsine de poulet diffère de la pepsine bovine et porcine par sa stabilité dans les solutions à pH neutre et modérément alcalin. Alors que la pepsine porcine était rapidement inactivée à pH supérieur à 6,5. La pepsine de poulet est stable aux pH de 8 à 8,5 (Tableau 4).

L’inactivation à pH 6,5 à 7 est une caractéristique particulière aux pepsines de la plupart des vertébrés.

DONTA et VAN VINAKIS (1970) ont pu séparer trois pepsinogènes de poulet (A, B et C) et leurs pepsines correspondantes présentent des différences dans la composition en acides aminés.

La composition en acides aminés montre que cette pepsine est moins acide que les autres pepsines étudiées. La pepsine de poulet contient 39 groupements carboxyles libres et 16 groupements basiques alors que la pepsine porcine contient 40 groupements carboxyles libres et seulement 6 groupements basiques (BOHAK, 1969).

L’activité catalytique de la pepsine de poulet est la plus élevée entre pH 1.5 et 4,5 avec un optimum à 2,8 en utilisant l’hémoglobine comme substrat. A pH 1.5, il y a 90% du maximum d’activité et à pH 4.5, 35% du maximum d’activité.

Le pepsinogène de poulet est stable à 24°C au dessous de pH 10,5 alors que la pepsine de poulet est stable au dessous de pH 8,0. A pH 8,5 et au delà la pepsine de poulet est rapidement dénaturée (BOHAK, 1969).

Dans le tube digestif de poulet, la pepsine est sécrétée au niveau du proventricule qui est située légèrement à gauche dans la cavité abdominale entre le jabot et le gésier (Figure 4).

C’est un ronflement fusiforme (de 3 cm de long en moyenne chez la poule) dont la muqueuse  est très riche en glandes à mucus. La paroi interne, très épaisse, est formée de lobules dont chacun constitue une glande composée, disposée radialement à l’axe de l’organe (ALAMAREOT, 1982).

Ces glandes en tube ont des orifices formant des rangées de mamelons visibles à l’œil nu. Les alvéoles de ces glandes sont bordées de cellules très spécialisées secrétant à la fois de l’acide chlorhydrique et une proenzyme protéolytique : le pepsinogène (LARBIER et LECLERCQ, 1992).

Le système de canaux collecteurs, s’ouvrant sur des petites papilles, apporte le suc gastrique dans la lumière du proventricule. Le chyme, provenant du jabot, séjourne dans le proventricule relativement peu de temps (de quelques  minutes à une heure) avant de passer dans le gésier.

Le suc gastrique entre en action avec les aliments dans le gésier, dans la première portion du duodénum et éventuellement dans le jabot où il arrive par des mouvements de renvoi.

Le volume du suc gastrique, qui varie de 5 à 20 ml/h en période de jeûne, atteint 40 ml après une stimulation à l’histamine.

Figure 4 : Appareil digestif du poulet (ALAMAREOT, 1982).
Figure 4 : Appareil digestif du poulet (ALAMAREOT, 1982).

2. Protéases dorigine végétale

Il existe plusieurs préparations coagulantes provenant du règne végétal. Elles sont extraites par macération de divers organes de plantes supérieures. Parmi les espèces connues on peut citer le gaillet, l’artichaut, le chardon qui ont été utilisés jadis dans des fabrications de fromages fermiers au Portugal et en Espagne (RAO et al., 1998 ; SOUSA et MALCATA, 2001 ; SILVA et MALKATA, 2005). D’autres extraits coagulants ont été obtenus à partir de plantes tropicale ; les plus connus sont la ficine ; extraite du latex de figuier, la papaïne ; extraite des feuilles de papayer, la bromélaine ; extraite de l’ananas. Ces protéases contrairement aux autres enzymes coagulants appartiennent au groupe de protéases sulphydryls (RAO et al., 1998 ; YAMAMOTO, 1975). D’une manière générale, ces diverses préparations végétales ont donné des résultats assez décevants en fromagerie car elles possèdent le plus souvent une activité protéolytique très élevée qui induit des pertes dans le rendement fromager et le développement de goût amère au cours de l’affinage. Ces difficultés résultent de la composition particulière de ces extraits, qui renferment des enzymes à site actif peu spécifique et /ou des systèmes enzymatiques dont il est difficile de maîtriser l’activité.

Toutefois, la purification des extraits de ficine a pu être réalisée et des fromages corrects ont été fabriqués à l’aide de ces préparations purifiées (RAMET, 1997). Cependant, le coût élevé de la collecte de la matière première et celui de la purification restent un facteur limitant à leur utilisation.

3. Protéases dorigine microbienne

3-1. Protéases dorigine bactérienne

De multiples espèces de bactéries ont été étudiées notamment dans les genres Bacillus et Pseudomonas tels que Bacillus cereus, Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis et Bacillus coagulans. Les résultats ont été en général décevants en raison de l’activité protéolytique généralement très élevée de ces protéases par rapport à celle de la présure. La protéase de Bacillus cereus dégradait rapidement la caséine entière. Du cheddar préparé par la protéase de Bacillus subtilis présentait une flaveur acceptable ; cependant, le rendement était très faible suite à une protéolyse excessive (ERNSTROM et WONGT, 1983 ; RAMET, 1997).

3-2. Protéases dorigine fongique

Les enzymes d’origine fongique, contrairement à celles d’origine bactérienne, ont donné des résultats meilleurs, souvent comparables à ceux obtenus avec la présure; les préparations commerciales employées actuellement proviennent de trois genres de moisissures; Cryphonecteria parasitica, Rhisomucor pusillus et Rhisomucor Miehei. (RAO et al., 1998 ). La protéase de Cryphonecteria parasitica a été étudiée et testée dans plusieurs types de fromage. Elle a donné des résultats variables. Elle paraît être plus protéolytique que la présure durant la phase de coagulation du cheddar (EMMONS et al., 1990). En outre, de l’amertume a caractérisé du cheddar préparé par cette protéase (KIM et al., 2004). Toutefois, l’emploi de ces protéases dans certains types de fromage tels que l’emmental a donné un fromage d’excellente qualité. En effet, ce type de fromage subit une cuisson à des températures élevées (51,7-54,4 °C) (RICHARDSON, 1975). Ce traitement thermique provoque probablement la destruction de l’activité protéolytique de ces enzymes, ce qui supprime, ainsi, leur effet au cours de l’affinage.

La protéase de Rhisomucor pusillus possède une activité protéolytique sur les caséines la plus faible comparée aux autre protéases d’origine fongiques (BARBANO et RASMUSSEN, 1992 ; EMMONS et al., 1990). Son emploi comme substitut de la présure, dans la fabrication de certaines variétés de fromage, a donné des résultats satisfaisants. Une légère amertume est relevée dans le cheddar fabriqué par cette protéase et seulement après 14 mois de stockage. Cependant, elle est plus protéolytique que la chymosine (RICHARDSON, 1975).

Comparée à la présure, la protéase de Rhisomucor miehei a donné un rendement et une qualité de fromage similaires, lors de la fabrication l’emmental. Aucun développement de l’amertume n’a été observé (RICHARDSON, 1975). Toutefois, comparé à la présure des pertes de matière grasse et de protéine, dans le lactosérum, plus importante, sont relevées lors de la préparation du cheddar avec les protéases de Cryphonecteria parasitica et de Rhisomucro miehei (EMMONS et al., 1990 ; BARBANO et RASMUSSEN, 1992).

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