L’identification d’une substance naturelle, produite par un organisme vivant n’est que l’une des toutes premières étapes du développement d’un nouveau médicament. Beaucoup de molécules à visée thérapeutique développées par des sociétés pharmaceutiques ont en fait été découvertes dans des laboratoires académiques. C’est toujours un continuum de la recherche fondamentale vers la recherche appliquée, souvent de la recherche publique vers la recherche privée, qui aboutit à la mise au point d’un médicament. Leur fabrication, directement à partir de substances naturelles, pose fréquemment le problème de l’approvisionnement en matière première. De nombreuses équipes du monde entier se heurtent aux difficultés de synthèse de ces molécules naturelles complexes. Donc l’identification d’une substance naturelle pour surmonter les obstacles et découvrir de nouvelles molécules de grand intérêt thérapeutique (JACOB, 2010).
1 La chromatographie liquide à haute performance (HPLC)
La HPLC est un moyen très flexible et simple d’isoler et d’identifier les différents composés d’un mélange. L’HPLC est un outil basé sur la chimie de quantification et de l’analyse des mélanges de composés chimiques, qui permet de connaître la quantité d’un composé chimique dans un mélange d’autres substances chimiques (MUANDA, 2010) .
a) Principe de l’HPLC
La chromatographie liquide à haute performance(HPLC) a la capacité de séparer, identifier et quantifier les composés qui sont présents dans un échantillon qui peut être dissouts dans un liquide.
C’est une méthode physico-chimique basée sur les différences d’interactions entre les molécules à séparer et les phases mobile et stationnaire. Préalablement, les solutés sont mis en solution dans la phase mobile (solvant). Après son injection, ce mélange passe sous haute pression au travers de la colonne qui renferme la phase stationnaire. Celle-ci est constituée de micro particules de silice, elle est très sensible aux impuretés, il est donc essentiel de purifier et de filtrer l’échantillon avant son injection en tête de colonne. La phase stationnaire interagit plus ou moins selon la nature des molécules de solutés, ce qui permet leur séparation.
Les diverses molécules sont éluées à des instants différents en fonction de la polarité de la phase mobile, ces temps sont dits de « rétention », ils dépendent donc de la nature de la phase stationnaire, de la composition de la phase mobile et des conditions analytiques.
Les composés sont identifiés grâce à un détecteur (absorptiométrique, réfractométrique, fluorimétrique, etc…) qui enregistre un signal et le transmet sous forme de pic (ROSSET, 1991).
b) l’Appareillage
Les différentes parties constituant l’appareil sont décrites ci-dessous:
- Pompe : un système de deux pompes, Pompe: LC 20AL, LC20AL pour déplacer la phase mobile à haute pression (plusieurs dizaines de bars) .
- Injecteur : c’est une vanne d’injection qui porte une boucle d’échantillonnage portant Volume d’injection: 20 µl.
- Colonne : (d’une longueur de 125 mm et d’un diamètre interne de 4,6 mm) contenant la phase stationnaire apolaire (phase inverse), cette dernière est constituée de silice modifié chimiquement par greffage de résidus (C-18), ces colonnes en phase inverse permettent la séparation des composés polaires, solubles dans l’eau ou dans les mélanges hydro-alcooliques ;elle contient la phase stationnaire qui définie le type de chromatographie, soit en phase normale soit en phase inverse. et l’éluant utilisé est constitue de deux compositions constante (H2O acide acétique, (0.2%),acéto-nitrile).
- Détecteur : un détecteur monochrome: UV SPD-20A à longueur d’onde variable (190-400 nm) qui permet de détecter les différents composés contenus dans l’échantillon à analyser. Notons qu’il est important que les produits à détecter portent un chromophore qui absorbe dans cette plage de longueur d’onde.
- Four: CTO 20A ( LEE et al., 2006).
2. Chromatographie en phase gazeuse (CPG)
La CPG est une méthode d’analyse par séparation qui s’applique aux composés gazeux ou susceptibles d’être vaporisés par chauffage sans décomposition (ARPINO et al., 1995). La CPG s’est montrée une méthode appropriée pour la séparation et l’identification des composants d’une mélange, elle réalise à la fois une analyse qualitative et quantitative (PARIS & GODON, 1979).
C’est la technique de séparation la plus utilisée car elle permet d’effectuer l’individualisation des constituants à partir d’échantillons de l’ordre du milligramme voire du microgramme. Les progrès technologiques réalisés dans le domaine des colonnes capillaires, des phases stationnaires et des détecteurs ont contribué à rendre la CPG incontournable pour l’analyse des composés volatils. Chaque constituant est caractérisé par des indices calculés à partir d’une gamme d’alcanes ou plus rarement d’esters méthyliques linéaires, à température constante (indice de Kováts) ou en programmation de température (indices de rétention) ( VAN DEN DOOL & KRATZ, 1963).
a) Principe de l’CPG
La chromatographie en phase gazeuse ou CPG s’applique à des échantillons gazeux ou susceptibles d’être volatilisés par élévation de la température.
Cette technique s’applique donc aux molécules de bas poids moléculaires (PM < 500 g mol-1) et aux composés stables avec la température. Pour les composés thermolabiles ou peu volatils, l’analyse ne sera possible qu’après des réactions de transformation (dérivatisation) (TESSIER & MADET, 2004). L’échantillon est vaporisé et injecté en tête de colonne. L’élution est assurée par un flux de gaz inerte qui sert de phase mobile. La CPG est basée sur le partage de produit analysé entre une phase gazeuse mobile est une phase (liquide ou solide) immobilisée sur la surface d’un support inerte (SKOOG et al., 2003).
Les constituants des mélanges appelés généralement « solutés » sont inégalement retenus par la phase stationnaire lors du transit dans la colonne. De ce phénomène appelé « rétention », les solutés injectés se déplacent avec une vitesse inégale entre eux et inférieure à celle de la phase mobile, ceci les conduit à sortir de la colonne les uns après les autres. On enregistre d’abord un signal dit ligne de base en présence du gaz vecteur seul, puis un pic au passage de chaque soluté séparé (TRANCHANT, 1995).
Les temps de rétention, bien que spécifiques d’un composé, ont tendance à varier d’une analyse à l’autre, notamment du fait du vieillissement des colonnes. Les indices de rétention polaire (IRp) et apolaire (IRa) sont comparés à ceux d’échantillons authentiques contenus dans des bibliothèques de référence élaborées au laboratoire, dans des bibliothèques commerciales ou répertoriés dans la littérature (NAIT ACHOUR, 2012).
b) constituantes de l’CPG
Dans cette technique chromatographique :
- la phase stationnaire est soit un liquide soit un solide .
- la phase mobile est un gaz qui balaie en permanence la colonne et qui est encore appelé (TESSIER & MADET., 2004).
Un chromatographie est constitué en première approximation de trois organes essentiels:
- l’injecteur
- la colonne
- le détecteur (SAALAOUI, 2011).
3. Le couplage Chromatographie phase gazeuse/Spectrométrie de masse (CPG/SM)
Le couplage CPG/SM est, aujourd’hui, la technique de référence (LONGEVIALLE, 1981 ; CONSTANTIN, 1996). Lorsqu’on soumet un composé moléculaire à cette analyse, on déclenche un processus à plusieurs étages (PRADEAU ET COHEN, 1992).
- Ionisation : les molécules présentes dans l’échantillon se volatilisent sous l’effet du vide et de la haute température (200ºC), il en résulte un mélange d’ions issus de la fragmentation de l’échantillion de départ .
- Accélération : Les ions formés se dirigent vers le dispositif de séparation sous l’effet d’un champ magnétique augmentant ainsi leurs énergies cinétiques.
- Séparation : Les ions seront distribués suivant leur rapport masse/charge .
- Détection : après séparation, les ions sont recueillis par un détecteur sensible aux charges électriques transportées .
- Traitement du signal : le signal de sortie de l’appareil conduit au spectre de masse qui constitue la représentation conventionnelle de l’abondance des ions en fonction de leurs rapports : masse/charge.
L’appareillage CPG/SM permet de fournir un chromatogramme accompagné d’un ensemble de spectres de masse correspondants à chaque pic chromatographique, ce qui permet l’identification précise de la majorité des constituants séparés par la CPG (LAIB, 2011).
Source:
AGUIEB, Zineb et MESSAI BELGACEM, Messaouda 2018 . Valorisation des arachides ( Arachis hypogea L.) cultivées à la Wilaya D’El-Oued.
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