أعداد معمل لتشخيص الأمراض النباتية

يجب أن يكون موقع وتصميم المعمل بعيداً عن التيارات الهوائية وتكون نوافذه مصممة لتقليل التلوث الداخلي للمعمل وتكون أرضيته وجدرانه ناعمة ومصقولة ليسهل تطهير وتنظيف المعمل يومياً.

وعادة يلحق بالمعمل غرفة للعزل مزودة بالكهرباء والغاز ومصباح من الأشعة فوق البنفسجية. ويجب أن يتوفر أيضاً بالمعمل العديد من الأجهزة والأدوات والمواد الكيماوية والبيئات والحد الأدنى لها كما يلي:

أولاً الأجهزة:

مجاهر تشريحية ومجاهر مركبة، أوتوكلاف (جهاز تعقيم بالبخار
تحت ضغط، حضانات، ثلاجات (لحفظ العينات المرضية) أفران الهواء
الساخن (لتعقيم الأدوات والزجاجيات)، حمامات مائية، أجهزة لقياس الحموضةpH  meters ، أجهزة الرج  Shakers، أجهزة تقطير المياه، موازين Balances أجهزة طرد مركزي Centrifuges خلاط Waring blender.

أجـزاء المجهـر المـركـب

مصدر الإضاءة: يوجد عند قاعدة المجهر.

المسرح:  يزود المسرح بماسك شرائح معدني يساعد على تحريك الشريحة (العينة المراد فحصها)  في جميع الاتجاهات بسهولة.

المكثف: يثبت المكثف عند نقطة مناسبة لتجميع الضوء، وإضاءة العينة.

حجاب المكثف: يفتح الحجاب بالكامل بواسطة تحريك ذراع صغيرة توجد أسفل المسرح، ثم يتم غلق الحجاب تدريجياً حتى نصل إلي  نقطة ما قبل انخفاض الضوء، وبذلك تكون أنسب فتحة للحجاب لتعطي أضل تمييز.

العدسات الشيئية: تعد العدسات الشيئية هي المسئولة عن التكبير والرؤية الواضحة، حيث تثبت العدسات الشيئية في قرص دائري يعرف بالقطعة الأنفية، وتكتب قوة التكبير على جانب كل عدسة شيئية.

العدسات العينية: تحتوي بعض المجاهر على عدسة عينة واحدة والبعض الأخر يحتوي على عدستين عينيتين ويجب ضبط المسافة بين العدسات العينية تبعاً للمسافة بين عينيك.

يكون التكبير الكلي للمجهر حاصل ضرب قوة تكبير العدسة الشيئية وقوة تكبير العدسة العينية (مثلاً عدسة شيئية 40 × وعدسة عينية 10 × يكون التكبير النهائي 400 × ).

الاستعمال السليم للمجهر:

• يحمل المجهر بواسطة اليدين.
• تنظيف المجهر:

تنظف العدسات بورق تنظيف العدسات مع استخدام الماء او محلول تنظيف العدسات، تنظف العدسة الزيتية بعد كل استعمال بواسطة قطعة من الشاش الجافة أو بورق تنظيف العدسات. تجنب وصول الزيت إلي العدسات غير الزيتية يفضل وضع غطاء واق من الغبار في حالة عدم استخدام المجهر. كما يجب إطفاء النور بمجرد الانتهاء من استعماله. حرك العينة على المسرح فإذا تحركت الأوساخ تكون الشريحة هي المتسخة. غير العدسات الشيئية فإذا اختفى الاتساخ تكون العدسة الشيئية السابقة هي المتسخة. أدر العدسة العينية فإذا دارت البقع المتسخة تكون العدسة العينية هي المتسخة.

• ضبط العدسات العينية لتلائم العينين.
• يتم ضبط الإضاءة.
• توضع الشريحة المراد فحصها على المسرح وتفحص بالعدسة الشيئة الصغرى حتى تصبح واضحة.
• يتم ضبط المكثف.
• يتم ضبط فتحة المكثف عند استخدام عدسات شيئية أكثر قوة.

ثانياً الأدوات:

أطباق بتري بلاستكية أو زجاجية معقمة، شرائح زجاجية وأغطية شرائح أنابيب اختبار وحوامل أنابيب اختبار، ماصات pipettes، كؤوس زجاجية، دوارق مخروطية، نواقيس زجاجية Bell jars أوعية لحفظ العينات Specimen jars، أدوات تشريح (ملاقط – ابر سهمية – أبر مستقيمة – ابر ذات العقدة  – مقص) أقلام تعليم للكتابة على الزجاج والبلاستيك).

ثالثاً: مواد كيماوية تستخدم في التعقيم:

• محلول هيبوكلوريت الصوديوم (كلوركس تجاري):

ويستخدم محاول الكلوركس التجاري  بتركيز 10% (10 مل كلوركس تجاري: 90 مل ماء معقم) في التعقيم السطحي للبنشات والتعقيم السطحي للأجزاء النباتية المصابة لعزل المسببات المرضية.

• كحول الإيثايل Ethyl alcohol :

يستخدم بتركيز 70% لتطهير الأيدي والعينات النباتية المصابة وتعقيم البنشات

• الفينول Phenol :

يستخدم بتركيز 2-5% للتعقيم السطحي لجدران وأرضيات المعمل ولحفظ العينات والنماذج المرضية.

رابعاً: الصبغات ومحاليل التحميل:

يجب صبغ (Staining) العينات حتى يمكن فحصها ميكروسكوبياً (معظم الفطريات ومقاطع الأنسجة النباتية) وأهم الصبغات الأكثر شيوعاً في معامل أمراض النبات.

• الصفرانيين Safranin: ميسيليوم والجراثيم الفطريات – خلايا بشرة النبات.
• أزرق القطن Cotton Blue: ميسيليوم وجراثيم الفطريات.
• محلول اللاكتوفينول: عبارة عن خليط من حامض اللاكتيك- الجلسرول – والماء والفينول وهو يعطي صورة جيدة اثناء الفحص المجهري ويضاف إليه أزرق القطن لأعطاء اللون للعينات الشفافة.

توضع نقطة من محلول التحميل (اللاكتوفينول) على شريحة مجهرية ثم توضع العينة (ميسيليوم أو جراثيم الفطر) وتستخدم ابرة تشريح لوضع العينة ثم ينزل غطاء الشريحة تدريجيا برفق وعناية لتقليل الفقاعات الهوائبة.

يمكن استخدام الشريط اللاصق Cellophane tape بتعريض الجانب   اللاصق للمزرعة الفطرية مما يؤدي إلي التصاق الجراثيم ثم يوضع فوق نقطة محلول اللاكتوفينول وبذلك يعمل الشريط اللاصق عمل غطاء الشريحة.

خامساً : البيئات المغذية:

تعد اختيار البيئة المغذية من أهم العناصر لنجاح عملية عزل المسبب المرضي من الأنسجة النباتية أو من التربة، وعادة تستعمل بيئات مغذية صلبة حيث يضاف لها مادة الآجار وتتميز بأنها تصلب البيئة السائلة وتعطي سطحاً متماسكاً وبالتالي يسهل ملاحظة النموات الفطرية أو التراكيب الثمرية التي يكونها الفطر (تحتوي معظم البيئات على 20 جم من مادة الآجار لكل لتر من البيئة المغذية)، والبيئات المحتوية على مادة الآجار تنصهر عند درجة حرارة 95 مْ وتتجمد عند درجة حرارة 40 مْ، وتستخدم أطباق بتري التي تحتوي على البيئة المغذبة في عملية العزل حتى يسهل تعريف الفطريات الممرضة، وتنقل المزارع الفطرية بعد تنقيتها إلي انابيب الأجار المغذي المائلة لحفظها في الثلاجة على درجة حرارة 5 مْ.

توجد أنواع عديدة من البيئات المغذية فقد تكون من مستخلصات نباتية مثل بيئة آجار البطاطس والدكستروز (PDA) أو بيئات تركيبية معروفة التركيب الكيماوي مثل بيئة تشابك دوكس. وتوجد بيئات أخرى متخصصة لعزل الفطريات.

من الأنسجة النباتية أو من التربة مثل بيئة كومادو Komdo media  لعزل الفطر فيوزاريوم Fusarium spp.

ويمكن تعريف الفطريات عن طريق الشكل المورفولوجي للمزرعة أو عن طريق وجود تراكيب ثمرية وعالباً تتميز البيئة الجيدة لعزل الفطريات بتشجيع النمو والتجرثم. وتعد بيئة آجار البطاطس والدكستروز (PDA) مناسبة وجيدة لعزل الفطريات وتعد من أكثر البيئات المستخدمة في معامل أمراض النبات

عزل المسببات المرضية الفطرية:

1. طريقة وضع الأنسجة في أطباق البيئة:

• يتم غسل الأجزاء النباتية المتسخة بالماء الجاري (الجذور).
• يعقم البنش بقطعة صغيرة من القطن مبللة بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم (محلول الكلوركس 10%) أو بواسطة 75% من كحول ايثانول.
• يفتح الغاز وإشعال اللهب (موقد بنزن).
• تقطع البقع (العينة المرضية) مع قليل من النسج السليم حولها إلي قطع صغيرة تتراوح من 2-4 مم.
• توضع القطع الصغيرة (نصفها من النسيج المريض والنصف الأخر من النسيج السليم) في طبق بتري يحتوي على محلول كلوركس بتركيز 10% لمدة تتراوح من2-3 دقائق أو أكثر، ويتوف ذلك على نوع وعمر النسج النباتي بادرات صغيرة العمر أو نباتات كبيرة – نباتات حولية  أو أشجار خشبية).
• يتم نقل القطع الصغيرة بواسطة ملقط معقم (يتم تعريض طرف الملقط فوق اللهب لدرجة الأحمرار ثم يغمس في كحول ايثانول 70% ثم يعرض للهب مرة اخرى) ثم تأخذ قطعة النسيج النباتي وتنقل إلي ورق ترشيح للتخلص من الزائد من محلول الكلوركس أو تنقل إلي طبق بتري يحتوى على ماء معقم ثم إلي ورق الترشيح.
• تنقل قطع النسيج النباتي من ورق الترشيح بعد التخلص من الزائد من محلول الكلوركس بواسطة ملقط معقم إلي أطباق بتري تحتوي على بيئة PDA حيث يوضع 4 قطع لكل طبق بتري وتكون كل قطعة بالقرب من حافة الطبق.
• تنقل الأطباق في الحضان على درجة حرارة 26-28 مْ وتوضع مقلوبة ويفضل وضعها داخل كيس بلاستيك أو لف الطبق بواسطة البارافيلم لمنع تلوثها بواسطة الحلم.
• الغرف الرطبة:

بعض الفطريات التي تصيب المجموع الخضري أو الأجزاء النباتية الموجودة فوق سطح التربة يمكن عزلها باستعمال الغرف الرطبة حيث تشجع  الفطريات على التجرثم وهي طريقة سريعة لتعرف على المسبب المرضي في خلال من1-2 يوم.

• يوضع في طبق بتري معقم ورق ترشيح مقاس 9 سم ثم تضاف قليل من الماء المعقم تكفي لتبلل ورقة الترشيح.
• توضع الأجزاء النباتية في الطبق الذي يحتوي على ورق ترشيح مبلل وتحضن الأطباق على البنش أو الضوء لمدة 1-3 أيام.
• يتم فحص الجراثيم لتعرف على المسبب المرضي أو تلقط الجراثيم بواسطة إبرة معقمة وتضع في طبق يحتوي على بيئة آجار البطاطس والدكستروز وتحضن في الحضان لمدة من 5- 7 أيام ثم تفحص الجراثيم بواسطة المجهر الضوئي.

تعريف المسببات المرضية عن طريق استخدام التقنيات الحديثة:

توجد أجهزة وتقنيات حديثة مثل طريقةPCR  وجهاز Biolog   لتعريف مسببات الأمراض الفطرية وتسهل الكثير من الأجهزة الحديثة من سرعة تشخيص المرض النباتي حيث أصبحت هذه الأجهزة الحديثة واسعة الانتشار.

The Biolog Systems

تتطورت طريقة هذا النظام منذ عام 1980 وهذا النظام The Biolog Systems يمكن عن طريقه تعريف أكثر من 1900 نوع من البكتيريا والخمائر والفطريات ويوجد منه ثلاثة أنواع:

1. Fully Automated systems
2. Semi Automated systems
3. Manually Read Systems

وتعتمد فكرة هذا النظام في تعريف الكائنات الحية الدقيقة (فطريات –
بكتيريا – خمائر) هي عندما يتوفر للكائن الحي مدى واسع من مصادر الكربون في طبق الخاص بالجهازMicro plate   فأنه ينتج بعض الصفات المميزة نتيجة عمليات الأيض وتعرف ببصمة الأصبع الأيضية Fingerprint) Metabolic.). وفي السنوات القليلة الماضية حدث تطور سريع في بصمة الأصبع الأيضية حيث انه يمكن الحصول على نتائج التعريف خلال 4 ساعات أو أقل وتقرأ وتسجل في ثواني، حيث انها تقارن بقواعد المعلومات وذلك لتعريف النهائي.

ويستخدم هذا النظام في مجالات تطبيقية (الزراعة – أمراض النبات- المكافحة الحيوية – الأبحاث – معامل التحليل وغيرها).

مكونات النظام:

تشمل على حضان incubator، تحليل البياناتAnalyzer ، جهاز كمبيوتر Computer ، طباعةprinter  ، سوفت وير Softwear لقراءة أطباق الجهاز  Biolog-micro plate ، مقياس على شكل مخروط لتجهيز وأعداد اللقاح inocula ، لمبة مضيئة لتكبير المزرعة، ماصة الكترونية بها 8 قنوات، قاعدة معلومات Databases.

ويتطلب التعريف وجود مزرعة نقية من الكائن المراد تعريفه (فطر – بكتيريا – خمائر) في بيئة النمو الخاصة بالجهاز (Biolog Universal Growth media)، ويمكن التأكد من المزرعة النقية عن طريق استخدام اللمبة المضيئة المكبرة لملاحظة أي تغيرات في الشكل المورفولوجي للمزرعة في اللون او الحجم أو حافة المزرعة.

FF Microplate: أطباق صغيرة لتعريف الفطريات

تحتوي على 96 حفرة (بئر) Well منها 95 حفرة تحتوي مصادر كربون مختلفة مع حفرة للشاهد تحتوي على ماء، وترتبط مصادر الكربون مع ملح التترازلويم Tetrazolium salt. تخفف العينة النقية وتوضع في الحفرة ثم تحضن في الحضان ويتم تحليلها بعد التحضين. إذا استخدمت البكتيريا مصدر الكربون أثناء عمليات الأيض حيث يحدث أكسدة للمادة التفاعل ويختزل التترازوليم وبذلك يظهر اللون الأحمر نتيجة اختزال ملح التترازوليم

(2,3,5, triphenyle tetrazolium chloride —–► triphenyl formazan)

ويتم قراءة الطبق بنظام قاعدة المعلومات السابق تخزينها.

وعن طريق هذا النطام يمكن تعريف حوالي 250 الف نوع من الفطريات عن طريق استخدام اطباق FF Microplate مع Microlog software. وفي المستقبل سيحلق بقاعدة المعلومات اشكال الفطريات على بيئة Malt Extract Agar  وبيئة Czapek Yeast Autoysate Agar  مع صور فتوغرافية مجهرية للفطر.

طريقة استخدام FF Microplate : (شكل رقم 1)

1. يتم تنمية المزرعة الفطرية على بيئة 2% (Malt extract Agar).
2. يتم مسح وتجميع الجراثيم الكونيدية للفطر من على سطح البئية الصلبة، ويأخذ معلق الجراثيم بكثافة معينة Specified Density)) ويتم تلقيح الأطباق FF Microplate
3. يضاف معلق الجراثيم بمعدل 100 ul في كل حفرة الموجودة في طبق FF Microplate
4. تحضن أطباق FF Microplate في الحضان على درجة حرارة 26م ْ لمدة 24-96 ساعة.
5. يتم قراءة الأطباق FF Microplate مستخدماً MicroStation Readear.

وتحتوي قاعدة المعلومات على أنواع مختلفة من الفطريات:

• الفطريات الممرضة للنبات:

مثل: Fusarium, Colletotricium, Phoma, Botrytis  وغيرها

• الفطريات الممرضة للإنسان:

مثل Stachybotrys, Scopulariopsis, Paecilomyces, Cladosporium, Alternaria, Fusarium, Aspergillus وغيرها.

• فطريات Indoor air:

مثل Pencillium, Aspergillus, Eurotium, Rhizopus, Stachybotrys, Neurospora, Wallemia  وغيرها.

• الفطريات البيئية الهامة :

مثل Trichoderma, Fusarium, Mucor, Acromonium, Verticillium, Aurebasidium,  Rhodotorula, Sporobolomyces

• فطريات تحمل بالغذاء Food borne fungi :

مثل Penicillium, ASpergillus, Ryizopus,Moniliella, Candida, Cryptococcus. Saccharomyces  وغيرها.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

أحياناً لا توجد أعراض أو علامات المرض تكون مميزة أو كافية لمعرفة المسبب المرضي، ولهذا يلزم أحضار عينات نباتية إلى المختبر لأجراء تفاعل متسلسل متطور PCR للكشف عن الكائنات الحية الدقيقة.

تـعد طريقة Polymerase Chain Reaction من الطرق التطبقية الواسعة الانتشار في مجال Molecular biology، وتستخدم هذه الطريقة في تضخيم amplify جزيئات حامض نووي معين يتواجد بين منطقتين معروفتين من سلسلة الحامض النووي  nucleotide sequence، وغالباً ما يوجد الحامض النووي بكمية صغيرة جداً في العينة البيولوجية المركبة. تضخيم جزيئات الحامض النووي يمكن تمييزها بواسطة تجزئة حجمها بواسطة Agraose gels والتفاعل الأنزيمي والتهجين بين سلسلة الحامض النووي. والخاصية التي يعتمد عليها هذا التفاعل PCR هو استخدام حامض نووي بعدد محدود من النيوكليوتيدات يمثله سلسة قصيرة الطول من الحامض النووي تكون هذه السلسة مكونة من 2 – 10 نيوكليوتيد (قاعدة – سكر – فوسفات) olignucleotide primers ، وهذه تحيط تماما بجزيء الحامض النووي المراد تضخيمه. وذلك يرجع إلي حساسية وتخصص هذه الطريقة PCR. وهذه الطرق لها تطبيق واسع المدى للكشف عن المسببات المرضية وأيضاً في تعريف المسببات المرضية وكثافتها ومتغيريها.

فوائد استخدام تفاعل PCR:

يمكن الكشف عن كميات صغيرة جداَ من المسبب المرضي.

تطور تفاعل PCR كان سريعاً حيث انه لا يحتاج إلي أجسام مضادة كما هو الحال في طريقة ELISA

اختبار PCR أكثر تطوراً للكشف عن الفيروسات التي تصيب الإنسان ويستخدم هذا الاختبار أيضاً للكشف عن الفيروسات النباتية والفيرويدات والفيتوبلازما لأن حساسية هذا الاختبار مفيدة في الكشف عن الفيروسات المعدية التي لا يمكن الكشف عنها بالطرق السيرولوجية ولا يعتمد اختبار PCR على وجود الأنتيجين (اى مادة أذا حقنت في جسم الإنسان أو الحيوان استحثت مصل الدم (السيرم) على تكوين أجسام مضادة antibodies)، وإنما يحتاج فقط إلي سلسلة من الحامض النووي. وفي وجود معلومات متاحة من molecular genetics لمسببات مرضية أخرى يتوقع أن اختبار PCRيصبح ذات أهمية كبيرة في التشخيص.

والعديد من العناصر يتطلبها اختبار  PCR وتشمل الأتي:

Thermal stable polymerase

هناك العديد من الأنواع المتوفرة على النطاق التجاري وتختلف في مميزاتها من حيث فعاليتها ودقتها.

إنزيم البلمرة أو مبلمر DNA (وهو إنزيم يحفز تكوين جزيئات DNA من وحدات دي اوكسي رايبونيوكليوتيدات (dATP-dGTP-dCTP-dTTP) ويعرف هذا الأنزيم أيضاً باسم DNA nucleotidyltransferase حيث يحفز مضاعفة DNA في مرحلة الانقسام الخلوي باستخدام وحدات دي اوكسي رايبونيوكليوتيدات (dATP-dGTP-dCTP-dTTP) ويحتاج التفاعل إلى ايونات الماغنسيوم وقالب DNA ويقصد به أحد الضفرتين حلزون DNA المسمي بالفرع النشط الذي تستخدمه الخلية في نسخ التسلسل النيوكليوتيدي الموجود عليه ونقله إلى جزئ من DNA.

بعض المصطلحات الهامة:

Primers (مبدئ أوفتيل):

ويقصد به أي مادة يحتاج إليها تفاعل البلمرة، وتستخدم المبتدئات في عمليات البناء الحيوي DNA  والبروتينات في أنبوب اختبار in vitro. حيث يتطلب Olignucleotides (حمض نووي بعدد محدود من النيوكليوتيدات يمثله سلسلة قصيرة الطول تتكون عادة من 2 – 10 وحدات نيوكليوتيد (قاعدة – سكر – فوسفات) لنزيم البلمرة polymerase وذلك لبدأ تخليق أو تركيب DNA، Olignucleotides تعرف أيضا باسم Oligos  أو باسم Primers، ويتم تصميم Primers لتثبيت طرف سلسلة DNA ومضاعفته أو تضخيمه (amplified).

dNTP :

PCR القياسي يحتوي على كميات متساوية من وحدات دي اوكسي رايبونيوكليوتيدات (dATP-dGTP-dCTP-dTTP) التى تكون سلسلة من الحامض النووي. إنزيم البلمرة أو مبلمر DNA (DNA polymerase Taq يستخدم وحدات وحدات دي اوكسي رايبونيوكليوتيدات لتخليق سلسلة جديدة من الحامض النووي أثناء اختبار PCR.

Divalent Cations (جزئ يحمل شحنة موجبة):

جزئ يحمل شحنة موجبة (الكاتيون هو أيون موجب يحمل شحنة كهربائية موجبة)، والعديد من انزيمات بلمرة DNA تحتاج إلي جزئ من الكاتيونات لنشاطها وتركيز الكاتيونات يؤثر على فعالية PCR، عادة يستخدم الماغنسيوم Mg²⁺ في أختبار PCR، و dNTP والمبدئ (الفتيل – Primers) يرتبط أيضاً بالماغنسيوم Mg²⁺  ويجب أن يكون تركيز الماغنسيوم متوفر حيث يحتاج التفاعل إلى أيونات الماغنسيوم اللازمة لنزيم بلمرة DNA (DNA polymerase). وعادة ما يكون التركيز المستخدم من الماغنسيوم Mg²⁺هو 1.5mM وربما قد يتم تغيير التركيز في حالة عدم نجاح اختبار PCR.

منظم الحموضة (Buffer):

ويقصد به محلول يحتوي على حمض وقاعدة أو ملح يعمل على حفظ تركيز ثابت  من ايون الهيدروجين فهي مادة تذاب في المحلول تقاوم التغيرات المفاجئة في الرقم الهيدروجيني PH حيث أن الأنزيمات التي تحفز سير التفاعلات تعمل في مدي صغير من هذا الرقم.كل الأنزيمات لها رقم هيدروجيني أمثل عند هذا الرقم تكون فعالة. وعادة ما يستخدم في اختبار PCR محلول بفر 10 mM TRIS-HCL  عند رقم هيدروجيني PH= 8.3-8.8 عند درجة حرارة الغرفة، وعند تحضين PCR عند درجة حرارة 72 م ْ والتي عندها يعمل Taq DNA polymerase على تضاعف سلسة الحامض النووي، ينخفض الرقم الهيدروجيني إلي حوالي 2 و 7 (PH= 7.2).

قالب  Template DNA :

وهو ضفيرة أو جديلة واحدة من ضفرتين الحلزون المزدوج يستخدم في عملية مضاعفة DNA،  ويقصد به احد ضفيرتي حلزون DNA المسمى بالفرع النشط الذي تستخدمه الخلية في نسخ التسلسل النيوكليوتيدي. وقالب DNA  أما أن يكون مكون من ضفيرة واحدة Single stranded أو من  double stranded (من ضفرتين من النيوكليوتيدات العديدة لتكون ما يعرف بالحلزون المزدوج وبكل لفة حلزونية عشر ازواج من القواعد النتروجينية والضفرتين لا يتشابهان في التركيب ولا في تعاقب القواعد النتروجينية،  فإذا وجد الأدينين (A) في احد الضفرتين يقابله دائماً الثيمين (T) في الضفيرة الأخرى وبالمثل الجوانين (G) يقابله السيتوسين (C)). ومن الممكن أيضاً عزل هذا القالب من الكائنات الحية مثل النبات أو البكتيريا، اختبار PCR يمكن نسخ العديد من DNA من السلسة المفردة ولكن العديد من الآلاف النسخ من DNA تضاف تفاعل الخليط.

The Polymerase Chain Reaction :

يتكون PCR من ثلاث خطوات عامة تكرر 30 مرة، وبعد كل دورة من الثلاث خطوات فان كمية المصنعة من DNA في التفاعل المزدوج حتي تستخدم عناصر التفاعل. تستخدم (الجهاز) الآلة المصنعة لدورة الحرارية لتسخين وتبريد PCR إثناء تكرار هذه الخطوات.

1. الخطوة الأولي: Denaturation

الخطوة الأولي هي تسخين DNA على درجة حرارة 95 م ْ ليتم فصل الضفرتين أو الحلزون المزدوج   (dsDNA)إلي ضفيرة مفردة Single strands))، وعامة هذه الخطوة الحاسمة تأخذ من 30-60 ثانية.

2. الخطوة الثانيةAnnealing :

الخطوة الثانية هي تبريد التفاعل حيث يرتبط انزيم البلمرة بقالب الحامض النووي ويعتمد ذلك على كيفية تبريد التفاعل لحدوث الأرتباط وتعرف درجة الحرارة هذه باسم Melting والعديد من الباحثين يستخدموا معادلات مختلفة لتقدير درجة الحرارة، حيث انه من الأهمية معرفة ذلك وعامة تكون درجة الحرارة المستخدمة تتراوح من 45- 60 درجة مئوية.

3. الخطوة الثالثة: Extension

وتجري الخطوة الثالثة لتثبيت الحراري لنزيم البلمرة  DNA polymerase (Taq) وذلك لتمديد سلسة الحامض النووي من إنزيم البلمرة عن طريق إضافة dNTPs لعمل سلسة جديدة من DNA، والوقت اللازم للتمديد يعتمد على سرعة تفاعل إنزيم البلمرة وطول الحامض النووي المختبر. وعادة ما تكون درجة الحرارة المستخدمة 72 م ْ وأحياناً تكون أقل من ذلك.

وعادة ما يكون برنامج PCR يحدث تضاعف 1500 من نيوكليوتيدات  لجزئ الحامض النووي في هذه الدورة الحرارية.

94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية

55 درجة مئوية لمدة 45 ثانية

72 درجة مئوية لمدة 90 ثانية

وهذه الخطوات الثلاثة يتم تكررها 30 مرة.

كل زمن من الدورة يكرر والكمية من الحامض النووي  المزدوج يتم استنساخه عندما تكتمل عناصر التفاعل ولذلك فانه:

الدورة الأولي                  2 نسخة

دورتين                                   4 نسخ

ثلاث دورات                            8 نسخ

أربع دورات                  16 نسخة

عشر دورات                            1024 نسخة

عشرين دورة أكثر من                 1.000.000 نسخة

. Polymerase Chain Reaction (PCR)

زيادة جزيئات الحامض النووي DNA باستخدام polymerase chain reaction يتم إجرائه عن طريق دورة حرارية    DNA Thermal Cycler أو Perkin-Elmer Cetus Thermal Cycler 9600 عن طريق إضافة كواشف التالية في أنبوب الطرد المركزي سعة 2 و 0 مل أو 5 و 1 مل: كمية صغيرة من جزيء الحامض النووي DNA cosmid, plasmid, or genomic DNA),)، وتشمل الطريقة 25-30 دورة عند 3 درجات حرارة: درجة حرارة قياسية 95 درجة مئوية، 55 درجة حرارة مئوية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 30 ثانية، 60 ثانية DNA Thermal Cycler ولمدة 60 ثانية Thermal Cycler 9600. وليتم التفاعل في الدورة الحرارية   DNA، يتم خليط التفاعل عن طريق إضافة نقطتين من الزيت المعدني قبل الدورة الحرارية لمنع تبخر وتكثيف السائل، وهذه الخطوة غير ضرورية لدورة الحرارية Thermal Cycler 9600 (عند درجة حرارة 100 مئوية) حيث تكون مزودة بغطاء حراري (غطاء الأنبوب الذي يحتوي على العينة) لمنع تبخر وتكثف السائل. وبعد إجراء التفاعل PCR يوضع الخليط في اجاروز جل أو electrophoresed للكشف عن نواتج التفاعل، في بعض الأحيان نجد إن الناتج من PCR المفرد غير كاف. ويتم الترسيب بواسطة الكحول الأثيلي في الدورة الثانية لزيادة  PCR.