الوسط الغذائى (البيئات المغذية) لزراعة الأنسجة

الوسط الغذائى (البيئات المغذية) لزراعة الأنسجة
شارك هذه المقالة مع أصدقائك!

إن نمو وتكشف الأنسجة النباتية فى المعمل يمكن التحكم فيه عن طريق نوع وتركيب الوسط الغذائى مع العلم بأن الإحتياجات الأساسية للأنسجة النباتية تماثل الإحتياجات الأساسية للنباتات الكاملة. ومن خبرتنا العملية يتضح أن الإحتياجات الغذائية تتباين طبقاً لنوع النبات المنزرع ويجب عند إختيار البيئة الغذائية مراعاة الإحتياجات الفعلية لكل نبات منزرع عليها.  فعلى سبيل المثال هناك بعض الأنسجة تنمو أفضل على وسط غذائى صلب عن النمو فى وسط غذائى سائل والعكس صحيح ولقد بذلت محاولات عديدة خلال السنوات الماضية لإختيار أفضل المكونات للوسط الغذائى الذى يلائم كل نوع من الأنسجة أو الأعضاء للنمو والتكشف. وفى هذا الجزء سوف نتناول بالتفصيل مكونات الوسط الغذائى .

1 – تركيب الوسط الغذائى  Media Composition                              

يتركب الوسط الغذائى عامة من مجموعة من العناصر المعدنية (عناصر كبرى وعناصر صغرى) بالإضافة إلى مصدر للكربون وهو أحد السكريات وبعض المواد العضوية الأساسية مثل الأحماض الأمينية والفيتامينات وكذلك منظمات النمو بالإضافة إلى الماء ومادة تصلب الوسط الغذائى مثل الآجار أو أحد مواد gelling agent وهناك بعض الأنسجة النباتية التى تستطيع النمو فقط على مخلوط العناصر المعدنية وليست بحاجة إلى مصدر الكربون (سكر) ولكن معظم الأنسجة النباتية تحتاج إلى إضافة بعض الفيتامينات والأحماض الأمينية ومنشطات النمو. فى بعض الأحيان القليلة جداً يضاف بعض المواد المعقدة إلى الوسط الغذائى.

هناك عدد من البيئات أو الأوساط الغذائية المتخصصة لكى يزرع عليها عضو نباتى معين أو نسيج معين.  وعلى سبيل المثال أول وسط غذائى وضع لنمو الجذور كان بواسطة العالم White (1934). ولإنتاج أعضاء وتكشف أول نبتة فى وسط غذائى كانت البيئة الموضوعة بواسطة Murashige and Skoog (M&S) (1962) و لنمو المزراع السائلة وضعت بيئة B5 بواسطة العالم Gamborg (1968) وبادخال بعض التعديلات والتحويرات فى مكوناتها أصبحت مناسبة لنمو معلق البروتوبلاست.  هناك العديد من البيئات المتخصصة فقط مثل N6 لنمو وتكاثر مزارع متوك النجيليات وهذه البيئة وضعت بواسطة العالم Chu  (1978)،  وبيئة s’ Nitsch بوسطة العالمان Nitsch and Nitsch  ( 1969 ) وكذلك أستخدمت هذه البيئة لنمو خلايا فول الصويا والبرسيم الأحمر وعديد من النباتات البقولية. وتتباين البيئات المختلفة فى درجة النجاح حسب نسب وعدد العناصر الغذائية المكونة لها.

فى الجدول التالى سوف نوضح المكونات المختلفة للبيئات الغذائية ويجب أن نشير هنا إلى أن تركيز المكونات المختلفة من العناصر المعدنية والعضوية تعطى فى صورة وزنية (مجم / لتر)

جدول يوضح المكونات الأساسية لبعض البيئات المستخدمة فى زراعة الأنسجة

إسم المكونالكمية (مجم / لتر)
WhiteMSB5Nitsch’sN6E1
عناصر كبرى
MgSO4. 7H2O

KH2PO4

NaH2PO4. H2O

KNO3

NH4NO3

CaCl2. 2H2O

(NH4)2 SO4

750

19

80

370

170

1900

1650

440

250

150

2500

150

134

185

68

950

720

185

400

2830

166

463

400

250

2100

600

450

عناصر صغرى
H3BO3

MnSO4.  4H2O

MnSO4.  H2O

ZnSO4.  7H20

NaMoO4. 2H2O

CuSO4.  5H2O

CoCl2.  6H2O

KI

FeSO4.  7H2O

Na EDTA.  2H2O

EDTA Na ferric salt

 

1.5

5.

3

0.01

0.75

 

6.2

22.3

8.6

0.25

0.025

0.25

0.83

27.8

37.3

 

3

10

2

0.25

0.025

0.025

0.75

43

 

25

10

0.25

0.025

0.025

27.8

37.8

 

1.6

4.4

3.3

1.5

0.80

27.8

37.8

 

3

10

2

0.25

0.025

0.025

0.80

43

 

Sucrose (g)203020202525
الفيتامينات
Thiamine HCl

Pyridoxine HCl

Nicotinic acid

Myo-inositol

Glycine

Folic acid

Biotin

pH

0.01

0.01

0.05

3

5.8

0.5

0.5

0.5

100

2

5.8

10

1

1

100

5.5

0.5

0.5

5.0

100

2

0.5

0.05

5.8

1

0.5

0.5

5.8

10

1

1

250

5.5

المراجع للبيئات المغذية الست المذكورة بالجدول:

White: White (1953) Am. J. Bot. 40, 517 – 524). MS: Murashige and Skoog (1962 )  Physiol. Plant. 15 : 473). B5: Gamborg et al.( 1968) Exp. Cell Res. 50: 151). Nitsch’s:(Nitsch and Nitsch 1969 )  Sci., N. Y., 163: 85).N6:  Chu (1978); Pro. Symp. Plant Tissue Culture, Sci. Press, Peking P. 43). E1: Gamborg et al. (1983). Plant Cell Rep. 2: 209).

وأحد مكونات البيئة الهامة هى منظمات النمو Growth regulators:-

وتوجد أربعة مجاميع رئيسية لمنظمات النموالهامة لمزارع الأنسجة وهى الأوكسينات، السيتوكينينات – الجبرلينات وحامض الأبسيسيك.  إن نمو الخلايا والأنسجة وتكشفها إلى البراعم الخضرية أو إلى الجذور يكون واضحاً جلياً عند إضافة واحد أو أكثر من هذه المنظمات إلى الوسط الغذائى وتتباين الإحتياجات المختلفة من منظمات النمو لتكوين الجذور أو تكوين البراعم الخضرية.  والتى تتشابه مع نسب الهرمونات الموجودة أساساً فى النبات الأصلى والتى تخلق به هذه الهرمونات ذاتياً وتضاف وتعقم أغلب هذه المنظمات بواسطة المرشحات البكتيرية نظرا لتكسرها بالحرارة العالية والضغط العالى (ظروف التعقيم). وهذة المجموعات هى:

 1- الأوكسينات Auxins                  

يوجد العديد من الأوكسينات التى تضاف إلى الوسط الغذائى نذكر منها على سبيل المثال إندول حامض الخليك  indole-3 – acetic acid ويرمز له (IAA) ، أندول حامض البيوتريك   indole 3 butyric acid ويرمز له (IBA) وكذلك 2 ، 4 دى كلورفينوكسىأسيتيك أسـد ويرمز له (2, 4 – D) 2,4 – dichlorophenoxy acetic acid . نفثـــالين حامض الخليـــك naphthoxyacetic acid  ويرمز له (NAA) ويوجد IAA طبيعياً فى الخلايا النباتية وهناك العديد من الأوكسينات التى تؤثر فى مزارع الخلايا والأنسجة ومن أهمها:

أ- الإندول أسيتيك أسد AA  I  

يشجع تكوين الجذور على النباتات وهذا المركب يجب إضافتة بواسطة المرشحات البكتيرية لأن تعقيمة بواسطة الأوتوكلاف مع البيئة يؤدى إلي تكسيرة وتقليل الإستفادة منة وكذلك يجب حفظة في زجاجة بنية أو قاتمة اللون لأنة يتأثر بالضوء ويضاف للبيئة في حدود 0.1 to 10 mg /L ويجب أن تحفظ البيئة المحتوية على هذا الهرمون في الإظلام التام حتى لايتكسر وتقل الإستفادة منة ويلاحظ أن الأوكسين لايذوب في الماء ويجب إذابتة أولا في كحول الإيثانول أو هيدروكسيد البوتاسيوم أو هيدروكسيد الصوديوم.

التحضير: يوزن100 مجم من حمض الإندول أسيتيك وتذاب في 2 مل هيدروكسيد الصوديوم 1 عيارى ثم يكمل الحجم إلي100 مل بالماء المقطر وفي هذه الحالة يكون 1مل = 1 مجم.  

ولقد أستخدم هذا الأكسين بنجاح لتكوين كالوسى نخيل البلح والفيكس كما أستخدم لإحداث الجذور (للتجذير) فى نباتات الجربيرا والكوردالين ونباتات الموز.

ب -الإندول بيوتريك أسد  IBA

من الأوكسينات الهامة التي تستخدم على نطاق واسع في مزارع الأنسجة النباتية بهدف تشجيع وتكوين الجذور وهذا الهرمون ثابت نسبيا بالمقارنة بحمض الإندول أسيتيك (IAA) حيث أنة يتحمل التعـقيم ولا يتكسر بالحرارة أو الضوء ويذوب أيضا في كحول الإيثانول وهيدروكسيد الصوديوم ويحضر كالسابق.

ج- نفثالين أسيتيك أسد NAA  

من المركبات الأوكسينية التي تستخدم بكثرة في مزارع الأنسجة النباتية لتكوين الكالوس وتشجع تكوين الجذور في المرحلة النهائية ويلاحظ أن الإتزان الداخلى للأوكسين والسيتوكاينين هو المحدد في جميع حالات نمو النبات وهذا الهرمون يذوب في كحول الإيثانول وكذلك هيدروكسيد الصوديوم ويحضر بإذابة 100 مجم منة في 2مل هيدروكسيد الصوديوم 1ع ثم يكمل الحجم إلي 100 مل بالماء المقطر وفي هذه الحالة يكون 1 مل = 1 مجم.  ويجب ملاحظة أن هذه الأوكسينات تتأثر تأثيرا كبيرا بال  pHوكمية الأملاح بالبيئة. وكثيرا ماتذكر التركيزات بالملى مول والميكرو مول وفي هذه الحالة يجب تحويلها إلي مليجرام وميكروجرام طبقا للآتى:

التركيز بالميكروجرام = التركيز بالميكرومول × الوزن الجزيئى

التركيز بالمليجـرام = التركيز بالملي مـول × الوزن الجزيئى

د- 2 ,4 داي كلورو فينوكسى أسيتك أسد “2, 4 – D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

وهو يتميز بأن تأثيره قوى في تخليق الأجنة العرضية وتكوين الكالوس ولكنة يعتبر مطفر. وقد درست أهمية الأوكسينات فوجد مثلا أن IAA هام جدا وضرورى لتصنيع DNA وإنقسام الخلية وقد وجد أنة بدون الأوكسين يحدث أن تنقسم الخلايا مرات قليلة ثم تموت وقد وجد أنة في مزارع نخاع الدخان أن إنقسام الخلايا يبدأ فورا بعد إضافة الأوكسين بالإضافة الى هذة الأنواع الرئيسية يوجد أوكسينات أخرى من أهمها:-

1-رابع كلورو فينوكسى حامض الخليك

4 – chlorophenoxy acetic acid (4- CPA)

  أو بارا كلورفونكسى حامض الخليك

P – chlorophenoxy acetic acid (PCPA)

  • 2، 4، 5 ثلاثى كلوروفينوكسى حامض الخليك

       2,4,5 – Trichlorophenoxy acetic acid (2, 4,5 –T)

3-         2 مثيل – 4 كلوروفينوكسى حامض الخليك

 2 – methy – 4 – chlorophenoxy acetic acid (MCPA).

4-         4 أمينو، 3، 5، 6 ثلاثى كلور حمض البيكنولينيك

4 amino  – 3, 5, 6- trichloropicolinic acid (picloram.)

5-         3، 6 داى كلورو – 2 ميثوأوكسى حامض البنزويك

3,6 – dichloro – 2 – methoxy benzoic acid. (dicamba).

 

والأثر الرئيسى للأوكسينات هو التأثير الواضح على إنقسام الخلايا فى الطبيعة والدور الرئيسى لهذه الهرمونات أنها تشارك بنشاط هام فى عملية إستطالة السلاميات والسيقان وتكوين الجذور. وتتباين الأوكسينات فى تأثيرها الفسيولوجى عن طريق قدرتها على التحرك خلال الأنسجة النباتية والإرتباط ببعض الخلايا.  وحسب درجة إنحدار وتقوس الساق النباتية فإنة وجد أن 2,4–D يؤثر بحوالى من 8 – 12 مرة ضعف تأثير IAA مقارنة بتأثير Picloram, PCPA الذى يؤثر من (2-4 مرات ) من تأثير 2, 4, 5 – T , 2, 4 – D , IAA وجد أنهم مؤثرين فى عملية إنتاج الكالوسات.

2- السيتوكينينات                      Cytokinins

إن مجموعة السيتوكينينات التى هى فى الأصل مشتقات من الأدينين تقوم بدور فعال ونشط فى إنقسام الخلايا وكذلك تحوير السيادة القمية وتكوين البراعم الجانبية. وهي من الهرمونات الهامة في مزارع الأنسجة النباتية والتى تساعد على إنقسام الخلايا وتكوين النموات الجانبية والمساعدة على الزيادة العددية أثناء إكثار النباتات وهذه الهرمونات تنشط تكوين الأفرخ والبراعم العرضية وتمنع تكوين الجذور خاصة عند إستعمالها بجرعات كبيرة ومنع تكوين الجذور يأتى من التأثير على الخلايا التي لاتنقسم والسيتوكينينات هي:

أ – سيتوكينين طبيعى مثل:

1 – الزياتين ، وهو مرتفع الثمن جدا يحدث تضاعف في مزارع الأنسجة النباتية.

 Zeatin)     6–(4hydroxy–3methyl–trans-2 butanylamino) purine

2 – زياتين رايبوزايد. Zeatin Riboside

3 – أيزوبنتنايل أدينين 2-ip يستخدم لإحداث التضاعف.  6– (y – y – dimethylamino) purine

ب – سيتوكاينين صناعى  وهذه المركبات عامة تذوب في حمض الهيدروكلوريك وتحضر بإذابة 100 مجم من المادة في 2مل 1 ع من الحمض السابق (5 -10 نقطة) ثم يكمل الحجم إلي 100 سم3 بالماء المقطر.  وعامة تستخدم هذه المركبات بتركيز من 0.01 to 10 mg/L وهذه المواد ثابتة وتحفظ في الثلاجة وتعمل على إنقسام الخلايا وزيادة النموات الجانبية ويستخدم كذلك مع الأوكسين لتكوين الكالوس وذلك عند الإتزان بين الأوكسين والسيتوكينين وهذه المركبات مثل:

1 الكينيتين Kinetin (6 فورفورايل أمينو بيورين) N – (2 furfurylamino)1– H – purine 6 amine

ويستخدم بكثرة في مزارع الأنسجة النباتية لإحداث التضاعف وتكوين الكالوس عند إتزانها مع الأوكسينات.

2 – بنزايل أمينو بيورين BAP 6- benzylaminopurine  يذوب في هيدروكسيد الصوديوم.

3 – البنزايل أدينين  BA   6 benzyladinine يـذوب في هيدروكسيد الصوديوم.

وعموما فإن هناك أهمية كبرى لنسبة الأوكسينات إلي السيتوكينينات وهذه النسبة تختلف من نبات إلي نبات آخر ومن نسيج إلي نسيج آخر ولكل حالة نسبة معينة تساعد على تكوين الكالوس أو تسمح بتكوين المجموع الجذرى فزيادة نسبة السيتوكاينين إلي الأوكسين يشجع تكوين البراعم العرضية والخضرية وزيادة الأوكسين تسمح بتكوين الجذور وتعادل النسبة يسمح بتكوين البراعم الخضرية والجذرية معا.

لقد وجد حديثاً أن هناك بعض مشتقات اليوريا مثل (DPU) والـ (CPPU) وبعض المشتقات الأخرى من diphenylurea تظهر نشاط مثل السيتوكينينات وتحتاج هذه المركبات إلى مزيد من الدراسات على إستخدامها فى مزارع الأنسجة لدراسة تأثيرها على نمو المزارع والخلايا وتعتبر نسبة وجود كل من الأوكسينات والسيتوكينينات فى الوسط الغذائى من العوامل المؤثرة فى عملية التكشف بالنسبة للخلايا والأنسجة المنزرعة. وينصح باستخدام بنسبة عالية من الأوكسينات إلى السيتوكينينات فى حالة الرغبة فى تكوين الكالوس وكذلك تكوين الأجنة وتكوين الجذور والعكس يقود إلى تكوين البراعم الخضرية ولقد لوحظ أنه عند إضافة الـ BA والـ 2,4 – D إلى الوسط الغذائى بنسبة 15 mg/ l-1 أدت إلى ظهور وتكون الكالوس فى مزارع Agrostis وعند إستخدامهم وإضافتهم بنسبة 0.5 mg/ l-1 ساعدت على تكون البراعم وفى كلتا الحالتين نسبة الأوكسين إلى السيتوكينين واحدة والطريقة التى تعمل بها السيتوكينينات ليست مفهومة بعد. ولكن وجد هناك إرتباط بين بعض المركبات والحمض النووى الريبوزى الناقل (tRNA) ولقد لوحظ أن السيتوكينينات أدت إلى زيادة فى تخليق الـ RNA ومن ثم زيادة فى تخليق البروتينات والإنزيمات داخل الخلية.

   3- الجبرلينات وحامض الأبسيسيك                      Gibberellins and Abscisic Acid                                 

تستخدم هذه المجموعة من منظمات النمو فى زراعة الأنسجة ولكن فى أحوال قليلة. هذه المجموعة تستخدم أحياناً لتنشيط النمو وأحياناً تستخدم لتثبيط النمو. إن حمض الجبريليك GA3 هو أكثر المجموعة إنتشاراً فى الإستخدام فى مزارع الأنسجة دون باقى العشرين نوعا المعروفة من الجبريلينات. وهذه المركبات فى الحقيقة تؤدى إلى زيادة فى النمو ولكن بكثافة أقل وتشجع النباتات المتقزمة على النمو والإستطالة. أما بالنسبة لحامض الأبسيسيك فإنه قد يشجع النمو أو يثبطة حسب نوع النبات والتركيز المستخدم. وهو من العناصر المهمة في منظمات النمو والوظيفة الأساسية لحمض الجبرالين هو تشجيع إستطالة الخلايا وتميزها. ولقد وجد El-Shobaky  (1991) أن إضافة  2/1- 2مجم من الجبرلين الى الوسط الغذائى أدت الى زيادة طول وعدد الأفرخ والجذور لعديد من أصناف البطاطس.  ولكن وجد أن لة تأثير مانع في بعض الحالات فقد وجد أن الجبرالين الطبيعى الموجود في الفاصوليا كان مانعا لتكوين الجذور وهو أثر غير مباشر في منع أنقسام الخلايا ومن المؤكد حاليا أن الجبرالين قد يمنع تجذير العقل في كثيرمن النباتات وكذلك يمنع تكوين الجذور العرضية عندما أضيف إلي أعناق أوراق البيجونيا. مما سبق نجد أن هذه الهرمونات تستخدم بتركيزات قليلة جدا (مجم/ لتر) ومنها ما يتكسر بالحرارة أثناء عملية التعقيم للبيئة ولذلك يفضل إضافة مثل هذه الهرمونات عن طريق المرشحات المعقمة.  وقد وجد كذلك أنة في حالة التوازن بين نسبة الأوكسينات والسيتوكينينات فإنة ينتج براعم خضرية وجذور.

درجة حموضة الوسط الغذائى  pH

تحتاج الخلايا والأنسجة المنزرعة إلى درجة الحموضة المناسبة للنمو وعند تحضير وإعداد الأوساط الغذائية يمكن تقدير درجة الحموضة وتعديلها إلى الدرجة المثلى للنمو والغرض من التجربة. تؤثر درجة الحموضة على درجة إستخدام الخلايا للأيونات الموجودة فى الوسط الغذائى. عموماً درجة الحموضة المثلى تتراوح بين 5 –6 قبل إجراء عملية التعقيم. الدرجة العالية من الحموضة تؤدى إلى زيادة فى صلابة الوسط الغذائى فى حين الدرجات المنخفضة من الحموضة تؤدى إلى درجة صلابة أقل من المطلوبة بالنسبة للوسط الغذائى. والأس الأيدروجينى هو اللوغاريتم السالب لتركيز أيونات الهيدروجين الموجودة في المحلول المحضر ويقاس قبل إضافة الآجار ويتراوح رقم الحموضة من 5.2 to 5.4  في البيئة السائلة ومن 5.6 to 5.8 في البيئة الصلبة ويضبط pH بالمحلول المنظم Buffer solution وهو ذلك المحلول الذى يقاوم التغير في ال pH ويقاس ال pH  باستخدام جهاز ال  pH meter ويلاحظ الآتى:

pH  المنخفض عن 4.5 أو الأعلى من 7 يؤثر تأثيرا سيئا على نمو النباتات.

تأثـير إنخـفاض ال pH  عن 4.5 فيحدث الآتى:

1 – يتأثر ثبات IAA والجبرالين والثيامين والكالوسيوم بانتوثيانيت.

2 – سيولة الآجار.

3 – تقل الإستفادة من أيونات الأمونيوم نظرا لقلة الإمتصاص.

4 – أيونات الحديد والمنجنيز تصبح في الغالب في صورة ذائبة بكميات كبيرة تجعلها سامة للنبات.

واذا  زاد pH  عـن ( 8 ) فإنة يحدث الآتى:

1 – يزداد تصلب الآجار.

2 – ترسيب أملاح الفوسفات والحديد فيقل الإستفادة منها.

3 – صعوبة نمو الجذور في بيئة الآجار المتصلب.

4 – تتأثر الهرمونات ومنظمات النمو الموجودة في البيئة.

5 – يقل درجة تيسر النحاس والحديد والمنجنيز والزنك فلايستفيد منها النباتات.

6 – يزيد درجة تيسـر المولبدنيم فيصبح سام للنباتات.

ويختلف ال pH قبل وبعد التعقيم حيث تنخفض فية ال pH  من 3 – 5 وحدة ويلاحظ أنة ينخفض أثناء نمو النباتات.

 أنواع البيـئات (حسب درجة تصلبها)                   Media types

يوجد ثلاثة أنواع من البيئات وهم البيئة الصلبة والبيئة السائلة والبيئة الشبيهة بالصلبة.

1 – البيئة الصلبة                                        Solid media

وهي البـيئة المضاف اليها آجار وهو إما فيتاجيل أو جيلريت أو بكتو دفكو آجار فيصلبها وكمية الآجار حوالي من 2 – 7 جم/ لتر وهناك أنواع من الآجار تصلب البيئة عند 2جم/ لتر وأفضل رقم حموضة لهذه البيئة  pH هو 5.7 واذا كانت البيئة الصلبة في أنبوبة إختبار يجب وضعها بميل بزاوية 45 درجة قبل التصلب بعد الخروج من الأوتوكلاف مباشرة وذلك لزيادة سطح البيئـة داخل أنابيب الإختبار.

2 – البيئة السائلة                                      Liquid media

وهي البيئة التي لايضاف اليها آجار وأفضل رقم حموضة  pH هو 5.5 وعند زراعة مثل هذه البيئة إما أن يوضع الجزء النباتى مباشرة في البيئـة أو إذا كان مرستيم فيحتاج إلي ركاب أو قنطرة من قطعة ورق ترشيح ويوضع المرستيم أعلى القنطرة ويصل إلية الغذاء عن طريق التشرب أو النشع وفي حالة زراعة الكالوس على البيئة السائلة يحتاج إلي هزاز Shaker لتجديد الهواء (التهوية) وجعل البيئة السائلة تصل إلي كل جزء من أجزاء النسيج.

3 – البيئة شبة الصلبة                             Semi-solid media

وهي البيئة التي يكون بها كمية آجار أقل فهي لاتكون صلبة ولا سائلة.

المواد المصلبة للوسط الغذائى         Solidifying Agents

تضاف المواد المصلبة إلى الوسط الغذائى للحصول على بيئات صلبة حتى يمكن الزراعة عليها. وتموت الخلايا إذا زرعت فى بيئة سائلة ثابتة حيث إنها تسقط داخل البيئة السائلة وتفقد الأوكسجين اللازم لتنفسها. وتعمل المواد المصلبة للوسط الغذائى على إتاحة فرصة للنمو على أسطح الوسط الغذائى ويعتبر الآجار من أفضل المواد المصلبة للوسط الغذائى وهو مستخلص من بعض الأعشاب البحرية.  والآجار عبارة عن معقد من السكريات وللأهمية نذكر هنا أن الآجار أو الجلاتين لا يتفاعل مع مركبات الوسط الغذائى. وكذلك لا تستطع الإنزيمات النباتية هدم هذه المركبات وتحليلها وتظل صلبة طول مدة النمو على مختلف درجات الحرارة. عادة يستخدم الآجار بنسبة 2-7 جم/لتر على حسب نوع الآجار وهى كمية كافية لتصليب أو تدعيم الوسط الغذائى عند نفس الأس الأيدروجينى المستخدم فى البيئة.

عند القيام بإجراء تجارب تغذية يستبعد إستخدام الآجار حيث إنه يحتوى على مجموعة من العناصر المعدنية التى تؤثر فى الوسط الغذائى مثل عناصر الكالوسيوم والمغنسيوم والبوتاسيوم والصوديوم وبعض العناصر الصغرى وعليه فإن التغير فى نسبة الأجار بالوسط الغذائى سوف تؤثر على كمية العناصر المعدنية الموجودة فى الوسط الغذائى. ويمكن التغلب على هذه النقطة فى تجارب التغذية عن طريق غسله فى ماء مقطر لمدة 24 ساعة ثم شطفه باستخدام كحول الإيثانول ثم التجفيف على درجة حرارة 60ºم لمدة 24 ساعة.

أما بالنسبة لمادة الجيلاتين  فإنها تستخدم بتركيزات أعلى 10% لتصلب الوسط الغذائى ولكن لا تستخدم بكثرة لأنه يتحول إلى مادة سائلة عند درجة حرارة أعلى من 25ºم بالإضافة إلى ذلك هناك العديد من المواد التى يمكن إستخدامها فى عملية تصلب الوسط الغذائى نذكر منها على سبيل المثال لا الحصر Gelrite, Phytagel, alginate, methacel يوجد فى الأسواق الآن نوع من الأجاروز النقى والذى يستخدم فى مزراع البروتوبلاست ومزراع الخلية الواحدة. أيضاً هناك طرق بديلة لحمل الخلايا  فى الوسط الغذائى السائل مثل إستخدام ورق سلوفان أو ورق ترشيح أو استخدام رغاوى البولى إثيلين. وعموماً فإن درجة النمو بالنسبة للأنسجة لا تعتمد أساساً على نوع النسيج والنوع النباتى المستخدم. ويعتبر الفيتاجيل من أفضل المواد المصلبة للبيئة حيث أنة يستخدم بتركيز منخفض 2جم/لتر وهو شفاف أى خالى من الشوائب ( El-Shobaky 1991).

إعداد البيئات             Media Preparation

إعداد البيئات الغذائية فى مجال زراعة الأنسجة قد يكون من أكثر العناصر إستهلاكاً للوقت. ولذلك توجد فى الأسواق الآن بيئات غذائية جاهزة على صورة مخلوط جاف من العناصر الكبرى والصغرى أو بقية المكونات الأخرى. وأبسط هذه الطرق أن تذاب هذه الكمية فى كمية من الماء. يذاب السكر والآجار فى كمية أخرى من الماء مع إجراء عملية إذابة ساخنة للآجار ثم تضاف بعض المكونات العضوية الأخرى مثل الفيتامينات ومنظمات النمو ثم تضاف الكميات معاً وتكمل إلى 1 لتر ويقدر الأس الأيدروجينى قبل ذلك ثم يجرى لها عملية التعقيم. على العموم تستخدم البيئات السابقة التجهيز فى عملية الإكثار الخضرى عن طريق زراعة الأنسجة ولكن فى حالة التجارب العلمية يفضل تحضير البيئات فى المعمل من مخاليط الأملاح على أن يوزن كل ملح على حدة ثم يذاب فى كمية من الماء ثم تجرى إذابة جميع العناصر المطلوب إضافتها فى التجربة حسب نوع الوسط الغذائى المستخدم وهذه عملية صعبة جداً. ولقد وجد بديل لهذه العملية على أن تحضر محاليل مُركزة (Stocks) بكميات كبيرة من هذه المحاليل والعناصر بكميات مضاعفة ثم عند إعداد البيئة نأخذ من هذه المحاليل الكميات اللازمة لإعداد الوسط الغذائى.

فعلى سبيل المثال تحضر محاليل الـ Stocks المُركزة للعناصر الصغرى بحيث يحتوى المحلول على 100 ضعف كمية العناصر التى يجب أن توجد فى الوسط الغذائى (حجم لتر) وتحضر المحاليل كالآتى:

Micro nutrients1X

mg/L

100 X

mg/100L

KI0.8383
H3BO36.2620
ZnSO4.7H2O8.6860
MnSO4.4H2O22.32230
NaMoO4.2H2O0.2525
CuSO4.5H2O0.0252.5
CoCl2.6H2O0.0252.5
Na2.EDTA37.33730
FeSO4.7H2O27.82780

وعند تحضير محاليل الحديد المخلبية تذاب كل من كبريتات الحديدوز المائية FeSO4. 7H2O وكذلك محلول الصوديوم Na EDTA. 2H2O كل على حدة فى 45 مل ماء بالتسخين والتقليب حتى تمام الذوبان ثم نخلط المحلولان  ثم يكمل المقدار إلى 100مل.

وكذلك تذاب كمية يوديد البوتاسيوم فى 85مل ماء ثم يكمل إلى 100 مل.

أما باقى العناصرالصغرى تذاب مع بعضها فى 70 مل ماء ثم تكمل إلى 100مل..

ومن ذلك يتضح أن العناصر الصغرى قسمت إلى ثلاث محاليل وعند تحضير لتر بيئة يتم أخذ 1مل من كل محلول..

كل المحاليل المركزة السابقة يجب أن تخزن فى أوعية زجاجية فى درجات حرارة منخفضة ويفضل الثلاجة. ومحلول الحديد يجب أن يحفظ فى زجاجة ملونة غير منفذة للضوء. عند إستخدام المحاليل المركزة هذه لابد من إجراء عملية الرج جيداً وإستبعاد أى محاليل تحتوى على ترسيبات أو أى ملوثات فطرية نهائياً.  تبذل عناية خاصة عند إستخدام لبن جوز الهند. محلول الأندوسبرم يرشح ويخزن فى زجاجة ملونة بألوان معتمة وتحفظ فى الديب فريزر على درجة – 20ºم والمحاليل الرئيسة لمكونات الوسط الغذائى

تحضير البيئة                     (MS) Stocks and Media Preparation

تشتمل تلك الخطوة إعدادStocks  من مكونات البيئة المختلفة (ذكرت سابقا) وتخزن على درجة حرارة 4 – 5° م لحين إستخدامها في تحضير البيئات المطلوبة.  وتحضير البيئة يتم بالوضع الآتى (لتر بيئة):

1 –        يوزن من 20 – 30 جم من السكروز أو حسب المطلوب.

2 –        يـوزن 100 مجم من الإينوزيتول.

3- توزن العناصر الكبرى كما موضح بجدول البيئات.

3 –        يؤخذ 1مل من كل من  الثلاث محاليل السابقة الخاصة بالعناصر الصغرى وكذلك يتم إضافة الفيتامينات كما هو موضح بجدول البيئات.

4 –        توضع الهرمونات على حسب نوع الهرمون والتركيز المطلوب.

5 –        يكمل الحجم إلي لتر ( 1000 سم3 ) بالماء المقـطر.

6 –        يضبط ال pH ويكون من 5.6 to 5.8 الصلبة ومن 5.5 to 5.2  السائلة.

7 –        يوضع الآجار لتصلب البيئة وهو حوالي 7جم/ لتر ويتوقف هذا على نوع الآجار وفي بعض الأحيان تكون سائلة بدون آجار وتطبخ البيئة على سخان بمقلب مغناطيسى حتى تمتزج جميع هذه المكونات.

8 –        تصب البيئة في برطمانات أو أنابيب إختبار حوالي 20سم للأنبوبة ثم تغطى بأغطية خاصة بذلك مصنوعة من مادة البولى بروبيولين التي تتحمل الضغط ودرجة الحرارة عند التعقيم.

9 –        تعقم الأنابيب أو البرطمانات في الأوتوكلاف على درجة حرارة 121°م وضغط جوى  1كجم / سم2 لمدة 20 دقيقة.

10 –      تبرد البرطمانات والأنابيب المحتوية على البيئة وتوضع الأنابيب مائلة في راكات خاصة بذلك بزاوية 45 درجة لحين الزراعة.

الخطوات المتبعة لزراعة الخلايا و الأنسجة النباتية:

أولا: إختيار الجزء النباتى:

1-إختيار نبات الأم   Selective of mother plants             

يجب أن يكون نبات الأم في حالة صحية جيدة وفي بداية نشاطه وذو صفات جيدة خالية من الأمراض خاصة الأمراض الفيرسية ويجب أن يكون قد خرج من طور الراحة إذا كان له طور راحة مثل الدرنات والأبصال.

2- إختيار الجزء الذى يزرع  Selective of an explant         

الأجزاء التي تستخدم هي القمم النامية للسيقان والجذور وأجزاء الزهرة وأجزاء من الثمار والبتلات والبذور وحبوب اللقاح والمتوك والمبيض والأجنة ونسيج النيوسيلة والإندوسبرم والفلقات والقشرة والنخاع والكمبيوم وهي الأجزاء المحتوية على مرستيمات أو أنسجة قابلة للتحول إلي الحالة المرستيمية ولكل نبات نسيج غالبا ما يكون أكثر ملائمة من غيرة. وهناك عدة إعتبارات من الواجب النظر اليها قبل إختيار الجزء الذى سيزرع وهي:

أ – الجزء النباتى المستخدم                                    Explant

ويقصد به المنفصل النباتى (قمة نامية-قمة مرستيمية-جزء من الساق-جزء من الورقة-المتك.. الخ ).

 ب – عمر المنفصل النباتى                              Age of Explant

عادة يفضل إستخدام المنفصل النباتى صغير السن وفي بعض الأحيان يفضل إجراء عملية التطويش لتكوين نموات حديثة أكثر نشاطا عند زراعتها ويمكن كذلك الحصول على النموات الحديثة القوية بإجراء عمليات التطعيم (الأصل الصغير بالطعم من النبات الكبير) وكذلك معاملة النباتات بالجبريلين وفي بعض الأحيان يستخدم مركبات السيتوكاينين حيث يشجع ذلك على تكوين النموات الحديثة.

ج – حجم المنفصل النباتى                           Size of Explant

لقد وجد أنة كلما زاد حجم المنفصل النباتى كانت نسبة النمو أعلى في معظم الحالات وكذلك يكون معدل التضاعف أعلى ولكن يعاب على هذه الطريقة أن نسبة التلوث تكون عالية وكذلك زيادة الإصابة الفيروسية – بينما في بعض الحالات يفضل أن يكون حجم المنفصل النباتى صغيرحتى يكون خالي من الأمراض وخاصة الأمـــراض الفيروسية وقليل التلوث. وقد وجد El-Shobaky  (1991) أن طول المرستيم (0.1-0.25 مم) أدت الى إنتاج نباتات خالية من الفيروس من نباتات مصابة من البطاطس.

د – موسم الحصول على المنفصل النباتى       Season of Explant

تكون الأعضاء النامية أكثر نشاطا في بداية موسم النمو (فصل الربيع) عن بـقية فصول السنة.

هـ نوعية وجودة مصدر النبات Quality of the Explant Source

يجب أن يكون مطابقا للأصل تماما وفي حالة نمو جيدة وخالي من الأمراض.

ثانيا: عملية التعقيم و الزراعة للجزء النباتى:

تعقيم الجزء المستعمل   Sterilization of the Explant

بعد الحصول على الجزء النباتى من مصدره الأمهات تجرى عليه عملية التعقيم كالآتى:

  • يغسل الجزء النباتى المستعمل تحت تيار من ماء الحنفية لمدة ساعة أو أكثر وهذه تقلل من نسب التلوث إلي درجة كبيرة وإذا كان السطح الخارجى مغطى بطبقة شمعية فإن غسيل الجزء المنفصل بإحدى مساحيق الغسيل يساعد على جعل السطح الخارجى أكثر قابلية للبلل.
  • يوضع في كحول إيثانول 70% لمدة نصف إلي واحد دقيقة ثم يغسل بالماء المقطر.
  • يوضع في هيبوكلوريت الصوديوم (الكلوروكس) 5 -20% لمدة ثلث ساعة مع الرج والتقليب المستمر.
  • يغسل بالماء المقطر المعقم 4-5 مرات للتخلص من آثار المادة المعقمة وبعدها يصبح الجزء النباتى قابل للزراعة. الخطوات من 2 حتى 4 تجرى داخل الهود.

-زراعة الجزء المستعمل على سطح البيئة    Culture of the explant              

يتم زراعة النسيج المستعمل بعد تعقيمه على سطح البيئة المعقمة المحضرة سابقا باستخدام أدوات معقمة وهذه الزراعة تتم داخل هود معقم وهذا في حالة البيئة الصلبة أما اذا كانت البيئة سائلة فيوضع الجزء النباتى المستخدم على ركاب منغمس في البيئة ويسمى (قنطرة) وهي من ورق الترشيح الذى يتشرب المحاليل وينقلها إلي الجزء المنزرع. ويفضل أن تكون البيئة المستخدمة في المراحل الأولى صلبة وقد تكون سائلة في المراحل التالية.

– تحضين المزارع         Incubation of the cultures   

ويتم تحضين المزارع في حضانة أو في غرفة نمو Growth Chamber التي تحتوى على ال Stands وهذه تحتوى على أرفف مضاءة توضع عليها المزارع والعوامل البيئية اللازم توافرها عند زراعة الأنسجة وهي رطوبة مناسبة للمحافظة على الأنسجة من الجفاف ودرجة حرارة مناسبة وإحتياجات ضوئية مناسبة. الإحتياجات البيئية المطلوبة هي:

أ – الإحتياجات الضوئية  Light requirement  وتشتمل على:

1 – الكثافة الضوئية                                  Light intensity       

تحتاج الأنسجة النباتية التي تم زراعتها في أوعية تحتوى على بـيئـة مغذية إلي ضوء لمساعدتها على نشأة وتخليق الأعضاء Initiation فالضوء ينظم عمليات التشكل Morphogenetic processes فهو يساعد على تكوين مبادئ الجذور والسوق وتخليق الأجنة النيوسيلية والأجنة الخضرية العرضية من نسيج الكالوس ولعل صعوبة تكشف الأعضاء في بعض الزراعات الغير ناجحة يرجع إلي عدم تعرضها لشدة الإضاءة المناسبة وقد لوحظ أن زراعة الأنسجة يلزمها التدرج في شدة الإضاءة من 1000 إلي 3000 لوكس وهناك بعض المزارع تحتاج إلي10000 لوكس. الكثافة الضوئية كانت مفيدة لإستطالة النباتات وزيادة عدد الأوراق وطول وعدد الجذور فى البطاطس (El-Shobaky 1991).

2 – الفترة الضوئية                                      Photoperiod

تحتاج معظم المزارع إلي 16 ساعة إضاءة و 8 ساعات إظلام وهناك البعض يحتاج إلى  12 ساعة إضاءة ومثلها إظلام وفي حالة الحصول على الميكروتيوبرز من البطاطس فإنها قد تحتاج إلي ضوء خافت أو إلي إظلام تام.

ب – الإحتياجات الحرارية                         Heat requirement  

في معظم الأحيان تكون درجة الحرارة 22 – 27°م هي أنسب درجة لنمو مزراعة الأنسجة بالنسبة لنباتات المناطق المعتدلة إلا أنة في النباتات الإستوائية ونباتات المناطق الحارة يكون تكشف الأعضاء بصورة أفضل في درجات حرارة تتراوح ما بين 27 – 35°م وقد وجد أن أفضل درجة حرارة للبراعم الخضرية على نبات الدخان كانت 18°م.  درجة الحرارة 20-25ºم كانت مناسبة لزيادة عدد الأفرع والأوراق وطول وعدد الجذور لنباتات البطاطس النامية فى أوعية الزراعة El-Shobaky (1991).

ثالثا: عملية االأقلمة و الزراعة فى التربة و الحقل للنباتات المستولدة:

بعد تمام تكون النباتات داخل البرطمانات تأتى عملية الأقلمة

أقلمة النباتات                           Acclimatization 

يجب تقسية النباتات قبل النقل وذلك بتعريض النباتات لشدة إضاءة عالية 10000 لوكس ثم نقل النباتات إلي أصص تحتوى على بيت موس والفيرمكوليت وتزرع النباتات تحت ضباب Under mist ويفضل تدفأة قاعدة أوانى الزراعة فإن ذلك يشجع المجموع الجذرى وتغذى ب ½ محلول هوجلاند أسبوعيا وبعد 3 – 4 أسابيع تنقل النباتات في الظل ثم تدريجيا في الجو الخارجى بأرض المشتل أما النباتات التي لها طور راحة مثل الكورمات فيجب إستيفاء درجات الحرارة لكسر طور سكونها.  وفي هذه المرحلة تؤقلم النباتات في حجرة الأقلمة وتنقل إلي الصوبة أو الحقل وتزرع في تربة مكونة من البيت موس والرمل بنسبة 1 : 1 بالحجم وأحيانا يضاف بيرليت أو فوم لزيادة التهوية ثم ترش بعد ذلك بمحلول غذائى متكامل وأحيانا يستخدم هرمون تجذير لتشجيع تكوين مجموع جذرى وغالبا ما تتم هذه العملية في حضانات مجهزة لذلك ومزودة بعدادات لدرجات الحرارة ليلا ونهارا وأخرى للرطوبة والإضاءة    (شدة الإضاءة – عدد ساعات الإضاءة) وهذا على النطاق البحثى أما على النطاق التجارى فإنها تتم في صوب مجهزة لذلك وغالبا مايستخدم نظام الرى بالرش (الضباب) أو التغطية بأكياس البلاستيك.  وهذه المرحلة هي الترجمة النهائية للعمل في مزارع الأنسجة وهي هامة للغاية ويجب ملاحظة أن لكل نبات طبيعة خاصة في الأقلمة.

الزراعة في الصوبة أو الحقل   Greenhouse and Field  الهدف من هذه المرحلة هو إعداد النباتات بصورة صالحة للنقل للتربة حيث تتوقف طريقة الإكثار الناجحة باستخدام زراعة الأنسجة على الإعداد الجيد لهذه النباتات وذلك بتجذيرها حيث تزيد نسبة الأوكسين في البيئة في هذه المرحلة ويقل أو لايضاف السيتوكاينين ويجب معرفة طبيعة النباتات فمثلا:

1 – النباتات التي لها دور سكون فيجب كسره بالتعرض لدرجات الحرارة المنخفضة لفترة زمنية معينة.

2 – بعض النباتات تعمل على تقليل كمية السكر والأملاح في البيئة وزيادة الإضاءة تنشط إنزيمات البناء الضوئى لزيادة الكفاءة التمثيلية للنباتات فيسهل أقلمتها.

3 – وفي بعض الأحيان تنقل النباتات مباشرة من المرحلة الثانية إلي التربة مباشرة مع إستخدام هرمونات التجذير.

ما يجب مراعاته فى الخامات المستخدمة عند إعداد البيئة الغذائية

  • الماء يجب أن يكون مقطراً ومنزوع منه الأيونات.
  • المواد الغذائية مثل الأملاح والمواد العضوية وخلافه لابد أن تكون من ذات درجة النقاوة العالية والهرمونات ومنظمات النمو يجب أن تكون على صورة بلورات نقية والأحماض الأمينية يجب أن تكون من L isomer .
  • لإعداد بيئة صلبة لابد من إستخدام آجار من نوع Bacto agar من شركة Difco أو من النوعيات عالية الجودة ومناسبة السعر .
  • تذاب كمية الأجار المطلوبة وكذلك السكر المطلوب وجودها فى الوسط الغذائى فى حوالى ثلاثة أرباع لتر من الماء عن طريق التسخين فى حمام مائى أو فى الأتوكلاف وهذه الخطوة غير ضرورية فى حالة البيئات السائلة لأن السكر يمكن إذابته فى أقل كمية من الماء الدافئ.

 

خطوات العمل:

1-         الفيتامينات ومنظمات النمو يمكن إضافتها إلى الوسط الغذائى بعد إجراء التعقيم له وذلك لأن هذه الفيتامينات ومنظمات النمو يجب أن تعقم عن طريق الترشيح خلال مرشحات دقيقة جداً تتراوح أقطار فتحاتها من 0.22 إلى 0.45 ميكروميتر.

2-         ضبط وتعديل درجة الحموضة يتم باستخدام محلول هيدروكسيد الصوديوم عشر عيارى أو محلول عشر عيارى من حامض الهيدروكلوريك .

3-         توضع البيئات السائلة قبل التعقيم فى أوعية زجاجية ذات أحجام من نصف لتر إلى واحد لتر. وإذا لوحظ تجمد لهذه البيئات السائلة يعاد تسخينها مرة أخرى.

4-         توضع البيئات فى أوعية زجاجية قابلة للتسخين وبمعدل 4/3 أرباع الوعاء فقط ثم تغلق بواسطة سدادات من ورق الألمونيوم وتعقم على درجة حرارة 121°م تحت ضغط جوى 1 كجم/ سم2 لمدة تتراوح ما بين 15 – 20 دقيقة.

5-         بعد أن تنتهى عملية التعقيم وتصل درجـة حرارة الأوتوكلاف إلى 60ºم تخرج البيئات وتصب فى أوعية معقمة.

6-         يمكن أحياناً صب البيئات فى أوعية الزراعة ثم تعقم البيئة مع أوعية الزراعة سوياً داخل الأوتوكلاف.

7-         فى حالة المزارع السائلة توضع فقط حوالى 5/1 حجم الوعاء فقط بيئة غذائية.

8-         فى النهاية تبرد البيئة إلى درجة حرارة الغرفة ويمكن تخزينها على درجات حرارة تتراوح ما بين 4 – 10º م.

 

حمل التطبيق الرائع الهندسة الزراعية للأندرويد 

       من هنا

الفهرس

تعليق واحد

تعليق واحد

أضف تعليقا

  1. ارغب بالحصول على بعض الاستشارات الزراعية فكيف اتواصل معك.

اترك تعليقاً

هذا الموقع يستخدم Akismet للحدّ من التعليقات المزعجة والغير مرغوبة. تعرّف على كيفية معالجة بيانات تعليقك.