الدراسة الكيميائية للفلافونيدات

يتم الاصطناع الحيوي للفلانويدات في الجزء الهوائي للنبتة لارتباطه بالعامل الضوئي لذا فـإن عمليـة استخلاص الفلافونويدات تتم عموما على هذه الأجزاء.

1 – الاستخلاص:

تستخدم تقنية الاستخلاص بالمذيبات في الكيمياء العضوية لفصل المواد من مخاليطها لكن قبل الشروع في عملية الاستخلاص يستحسن الاشتغال على النبات مجففا وذلك تفاديا للتفاعلات الإنزيمية التـي قـد تحدث تغيرات على المركبات المستخلصة،بالنسبة للمركبات الفنولية يسـتحب الاسـتخلاص بمحاليـل كحولية:

المثانول، الإيثانول، اضافة الى الماء بنسب مختلفة حسب حالة النبات .

بعد التركيز و التخلص من أكبر كمية ممكنة من الكحول المستعمل، تعامل الرشاحة المائية بإيثر البترول عن طريق استخلاص سائل – سائل، حيث يتم التخلص من المركبات الطبيعية ذات القطبية الضعيفة مثل: الدهون، التربينات و الكلوروفيل بعدها يتم استخلاص انتقائي لمختلف المركبات: كالفلافونيدات مختلفة التراكيب و القطبية، أكثر المذيبات استعمالا: خلات الإيثيل و البوتانول حيث يساعد الأول على استخلاص الاجليكونات عديدة الهيدروكسيل و كذلك أحادية السكر بينما يستخلص المذيـب الثاني الفلافونيدات عديـدة السكر و الايثروزيدات من نوع ،C- glycosideو يشير المخطط -1 -إلى مختلف مراحل عملية الإستخلاص.

2 – الكشف عن الفلافونيدات׃

هناك مجموعة من التفاعلات تسمح بالكشف عن الفلافونيدات- الاجليكونـات، الايثروزيـدات- فـي المستخلصات الخامة و يعتبر التحليل بكروماتوغرافيا الورق و بمطيافية الأشعة فوق البنفسـجية هـو الدراسة الأولية المألوفة و المهيمنة على هذا النوع من المستخلصات. معظم الفلافونيدات لا يكون مرئيا مباشرة على كرومـاتوغرام الـورق باسـتثناء الأرون،الشـالكون، الأنتوسيانين.لذا تتم دراسة الكروماتوغرامات إما بالفحص باستخدام الأشـعة فـوق البنفسـجية (عنـد 365ن.م) قبل و بعدالرش بكلوريد الالومنيوم ،AlCl3قبل و بعد الرش بأبخرة محلـول مركـز مـن النشاذر NH3حيث يعطي نوع و تغير التوهج، معلومات أولية هامة و مفيدة عن طبيعـة الفلافونويـد الموجود و يوضح الجدول – -7العلاقة بين لون المركب و بنيته الكيميائية تحت الأشعة فوق البنفسـجية من غير استعمال أبخرة النشادر و مع استعمالها.

الجدول 1 : علاقة لون المركب و بنیتھ الكیمیائیة تحت الأشعة فوق البنفسجیة مع و دون النشادر

3 – الفصل و التنقية:

تعتبر الكروماتوغرافيا بمختلف أنواعها التقنية الأساسية الأكفأ لفصل و تنقية المركبات العضوية عموما، فكروماتوغرافيا العمود تعد الطريقة الأنجع لفصل الكميات الكبيرة و الأكثر تعقيدا، إذ تعتمد هذه الطريقة على الأطوار الثابتة: السيليكاجال و السليللوز و متعدد الاميد الذي يعتبر الافضل لكونه ُيمكن من فصل جميع الفلافونيديات خاصة الجليكوزدية منها و ذلك لاحتوائه على الوظيفة الاميدية السامحة بتشكيل روابط هيدروجينية قوية مع المجاميع الهيدروكسيلية .

و يعتبر ورق ،Whatman Iو III الأفضل في كروماتوغرافيا الورق التحليلية و التحضيرية على التوالي،

و من أشهر المذيبات المستخدمة في هذه التنقية نجد:

بالإضافة إلى هذه التقنية يستعان أيضا بكروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة ذات دعامة متعددة الأميد DC 6.6و DC 11و من اشهر جمل المذيبات المستخدمة في هذه التقنية نجد

و يتم تنقية المركبات المفصولة بالاستعانة بعمود صغير من متعدد الاميد باستعمال طوليين كمذيب و اغنائه بالقليل من المثانول ثم عمود من Sephadex LH20 باستخدام الميثانول كمذيب.

4  – التعيين البنيوي للفلافونيدات:

1.4 – السلوك الكروماتوغرافي:

من خلال السلوك الكروماتوغرافي للفلافونيدات نحصل على معلومات تفيدنا في معرفة بنى هذه المركبات،و هذا السلوك يتمثل في:

اللون الإستشعاعي و ثابت الاحتباس.

1.1.4 ثابت الاحتباس׃

يمكن تحديد قيمة ثابت الاحتباس كما يلي

من خلال قيمة معامل الاحتباس في مختلف المذيبات نخلص ما إذا كان المركب أجليكونا أو ايتروزيدا و کذا ما إذا كان عديد الميثوكسيل بالنسبة للأول أو أحادي أو ثنائي السكر بالنسبة للثاني ، و تزداد أهمية هذا المعامل عند استعمال شواهد معروفة.

الجدول 02: علاقة Rf ببنیة الفلافونید.

2.1.4 اللون الإستشعاعي:

تتميز الفلافونيدات بأنها تعطي ألوانا معينة تحت الأشعة فوق البنفسجية تساعدنا على التعرف على بنية الفلافونيد، فمثلا ظهور اللون الأصفرأو الأصفر الباهت يدل على أن المركب عبارة عن فلافونول به هيدروكسيل حر في الموقع 3 أو هيدروكسيل حر في 5.

2.4التقنيات الطيفية:

تعطي هذه التقنيات معلومات جد هامة ، تُضاف إلى تلك التي تحصلنا عليها من السلوك الكروماتوغرافي لنحدد بها بنية الفلافونيد المستخرج. و تتمثل هذه التقنيات في :

1. مطيافية الأشعة فوق البنفسجية .
2. مطيافية الرنين النووي المغناطيسي.
3. مطيافية الكتلة.

1.2.4مطيافية الأشعة فوق البنفسجية ׃

بالرغم من التطورات المعتبرة التي قطعتها تقنيات مطيافية الكتلة ( SM( FAB,IE أو مطيافية الرنين المغناطيسي النووي ( RMN (13C , 1H إلا أن مطيافية الأشعة فوق البنفسجية تبقى من أهم الوسائل المستعملة للتعرف على البني الكيميائية للفلافونيدات، نظرا للمعلومات الوافية التي تقدمها و لكونها لا تتطلب كمية كبيرة من المركب وكذا لسرعة انجازها.

كما أن للتغيرات التي تحدثها إضافة العديد من الكواشف أهمية بالغة في تعيين البنى .

• طيف الامتصاص في الوسط المثانولي:

يعطي طيف الفلافونويدات المحتوية على مجموعة كربونيل في C4 (فلافون، فلافونول) عصابتين I و  II تبعا للشكل الموالي

العصابةI:

ذات قيمة امتصاص عظمى في حدود (385-305ن.م) و هي راجعة إلى امتصاص الصورة cinnamoyl الناجمة عن ترافق مجموعة الكربونيل C4 مع الرابطة الثنائية و الحلقة .B إذ تسمح بتمييز الفلافونول عن الفلافون و تعطي معلومات عن التغيرات البنيوية للحلقتين B و C.

العصابة II:

ذات قيمة امتصاص عظمى في حدود ( 280-250ن.م) و هي راجعة إلى امتصاص الصورة Benzoyl الناجمة عن ترافق مجموعة الكربونيل مع الحلقة العطرية A .

إن تحديد شدة العصابتين ( Iو II) للطيف المنجز في المثانول يكشفان لنا عن طبيعة الهيكل الفلافونيدي و كيفية استبداله و هذا حسب الجدول -3 -و قد سمحت المقارنات التي أجريت بين أطياف الفلافونيدات المختلفة بالاستنتاجات التالية:

-الزيادة في عدد مجموعات الهيدروكسيل الحرة لمجموعة سينامويل يصاحبه عموما انزياح في اتجاه طول موجات اكبر” انزياح باتوكرومي” فعلى سبيل المثال طول موجة .

وجود مجموعة مثيل أو سكر في المواقع ‘7،5،3،4 الهيدروكسيلية يصاحبه ” انزياح هيبسوكرومي” (في اتجاه موجات اقل) .

الجدول – 3-أهم الانزياحات الملاحظة للعصابتين Iو IIفي الوسط المثانولي

إضافة كواشف أخرى:

إن إضافة كواشف معينة الى المحلول المثانولي مثل : …,NaOH,NaOMe, H3BO3,AlCl3,HCl تمكننا من التعمق أكثر في الدراسة البنيوية فتـوضح لنا بعـض الدلالات حول الهيكل الفلافونيـدي، و الجدول -4 – يوضح لنا مختلف تأثيرات الكواشف على طيف الأشعة فوق البنفسجية في الميثانول و تعليلاتها:

الجدول -4- : تأثیر الكواشف على طیف المیثانول و تعلیل مختلف التغیرات.

2.2.4 مطیافیة الكتلة:

تستعمل مطيافية الكتلة للتعرف على الكتلة الجزيئية و الشظايا التي تعطي عموما عدد و طبيعة المستبدلات الهيدروكسيلية أو الميثوكسيلية والشظايا المميزة للمركب تعطي معلومات حول توزيع المستبدلات بين النواتين B،A بالنسبة للفلافونيدات.

و تعرف هذه التقنية نجاحا كبيرا في هذا المجال مع تطور مختلف أنواع التأين التي تسمح بتحليل البنى الجليكوزيلية مثل تقنية الـ FAB و الأجليكونية مثل القذف الإلكتروني مثل تقنية الـ ،IEفمطيافية الكتلة تسمح بتحليل سريع جدا و فعال ناجح.

كما تمكن هذه الطريقة في كونها لا تحتاج إلى كميات كبيرة من العينة.

3.2.4مطيافية الرنين النووي المغناطيسي:

استخدمت مطيافية الرنين المغناطيسي النووي في نطاق واسع لدراسة المنتجات الطبيعية كالفلافونويدات فمن خلالها يمكن معرفة :

•  درجة تأكسد الحلقات A, B, C
•  عدد السكريات الموجودة في المركب و نوع الرابطة a, bبين السكر و الأجليكون.
•  عدد مجموعات المثوكسيل على الهيكل الفلافونيدي
• يتم الحصول على طيف RMNباستعمال مذيبات مختلفة مثل CDCl3الذي يعطي نتائج جيدة مع الأجليكونات و مذيب CD3OD, DMSO-d الذي يعطي نتائج جيدة مع معظم الجليكوزات و الأجليكونات.

بروتونات الحلقة C׃

يظهر بروتون C 3 للفلافون دائما في صورة أحادي حاد في المنطقة (6.4 -6.2 ppm) ويتداخل مع إشارة بروتوني الحلقة . H-6, H-8) A).

بروتونات الميثوكسيل  OMe-׃

وجود ميثوكسيل أو عدة ميثوكسيلات على الجزئ يظهر مجموعة من الإشارات الأحادية بين (3.8 – 4.5 ppm) .

بروتونات السكر׃

يظهر البروتون الآنوميري للسكر الأحادي﴿جلوكوز أو رامنوز ﴾ المتصل بمجموعة هيدروكسيل في المجال(4.2 – 6.0) ppm بينما باقي بروتونات السكر فتظر في صورة متعددة في المجال (3.5 – 4 )ppm،كما تظهر إشارة لمجموعة ميثيل سكر الرامنوز كثنائية بـ J=6Hz أو إشـارة متعددة عند ppm 1.2-0.8 .

4.2.4الحلمهة الحمضية:

بالإضافة إلى التقنيات السابقة يمكن الاستعانة بالتميه الحمضي للتعرف على عدد ونوع السكريات الموجودة في المركبات الجليكوزيدية إذ تعمل هذه التقنية على تحطيم الرابطة (كربون ـ أكسجين) الجامعة بين السكر والأجليكون.

والمخطط -2 -يبين الإماهة الحمضية للفلافونيدات الجليكوزيدية في حالة O–جليكوزيل و C–جليكوزيل.

يبين الجدول-5 -قيم الـ Rf لبعض السكريات الشائعة مأخوذة في النظام

أستون: ماء (10-90 ) على الدعامة  Gel de silice 60F254

الجدول 5 : قيم Rf لبعض السكريات الشائعة