التقانات الحيوية المستعملة لتحسين البطاطس

تعتبر البطاطس من أكثر النباتات التي تعتمد على تقانات الزراعة النسيجية لتحسينها (Richard 2005)؛ من بين هذه التقانات نذكر:

1 التحويل الوراثي La transformation génétique

يتم تحويل مورثات اما من كائن إلى آخر أو في نفس الكائن، بهدف إنتاج نباتات ذوات خصائص وراثية جديدة، وفق طريقين أساسيين (2003 ,El hamdouni et al . , 1999 ; Erics )؛ يتم إما بالتحويل المباشر للمورثات بفضل الناقل البكتيري Agrobacterium tumefaciencs ، او بالحقن المجهري.

فيما يخص البطاطس تبقى الفائدة من التحويل الوراثي تكمن في الحصول على مقاومة المضادات الحيوية أو الفيروسات (1996 ,.Rousselle et al)، فمن العائلة الباذنجانية المحولة وراثيا، نجد الطماطم المحولة بواسطة بكتيريا Agrobacterium tumefaciens لتركيب بروتين Zamir et Neomycine phosphotransferase (1984 ,.al)، البطاطس المحولة بالبكتيريا Agrobacterium tumefaciens لإنتاج بطاطس مقاومة لل Raffaela et al., 1988) Kanamycin).

2 تقنية أحادية ثنائية الصيغة الصبغية

L ‘ haplodiplomethodes وصفت هذه التقنية لأول مرة من طرف Maheshwari Guha سنة 1964، تعتبر تقنية حديثة تستعمل التحسين وتطوير النباتات (2007 ,.Aminul et al). تسمح بإنتاج سلالات أحادية الصيغة الصبغية مضاعفة تعرف باسم El hamdouni et al . , 1999 ; Natalija et al . , 2004 ) Haplométhodes Haploides – doublees )، حيث يمكن الحصول على نبات ثنائي الصيغة الصبغية، ثم أحادي الصيغة الصبغية، انطلاقا من نبات رباعي الصيغة الصبغية (2007 ,. Dubois , 1989 ; Aminul et al)، تتم بزراعة خلايا (حبات اللقاح) “Androgenes” أو أعضاء المبايض) ” Dubois , 1989 ) ” Gynogenese )، وتنتج سلالات خالصة ما يعادل عشر سنين من الإنتاج عبر الإلقاح فهي مربحة جدا للوقت. كما تسمح بإنتاج نباتات متماثلة العوامل الوراثية “Homozygotes ” وهذا في مرحلة واحدة من الزراعة النسيجية (1999 ,.El hamdouni et al).

تؤثر درجة تعدد الصيغة الصبغية عند البطاطس، على تواتر ونمط التغيرات المحصل عليها (Yeoman 1992 ,. M . , 1986 ; Filippone et al ). حيث تحدث التغيرات الوراثية أكثر، عند الأنواع متعددة الصيغة الصبغية منها عند الأحادية وثنائية الصيغة الصبغية (1994 ,.Wang et al).

تم الحصول على بطاطس ثنائية الصيغة الصبغية (24 = 2n = 2x ) انطلاقا من بطاطس رباعية الصيغة الصبغية (48 = 2n = 4x ) من طرف (1973 ,.Dunwell et al)، وأحادية الصيغة الصبغية ( 12= 2n= x ) من طرف (1978 ,.Sudhir et al).

3 التهجين الجسمي Hybridation somatique

آن هضم الجدار السليلوزي لأي جزء من النبات بإنزيمات خاصة، يجعل الخلية النباتية محاطة بالغشاء الهيولي فقط، مشكلة البروتوبلاست (2003 ,Oluf et al . , 1975 ; Eric )، والذي يمكنه استقبال عناصر نووية وهيولية غريبة دون رد فعل، حيث يمكن الجمع بين بروتوبلاست لنوعين، جنسين، أو حتى مملكتين بيولوجيتين مختلفتين، وهي عملية الدمج الجسمي، وناتج العملية هجين جسمي (1989 ,Demarly et Sibi).

تعتبر العائلة الباذنجانية من أكثر العوائل النباتية نجاحا في إجراء التهجينات الجسمية، فعند البطاطس كانت مع أنواع أخرى من Solanum مثل nigrum berthaulti ، Solanum chacoense ، Solanum Solanum من اجل الرفع من مقاومة الملوحة (2007 ,.Amira et al). أو بين البطاطس وأجناس أخرى مثل الطماطم Lycopersicum esculentum. أو بدمج بروتوبلاست نوعين من البطاطس ثنائيي الصيغة الصبغية، الإنتاج هجين جسمي رباعي الصيغة الصبغية (1991 ,.Sylvia et al)

4 التباين الجسمي Variation somaclonale

4 . 1 تعريف التباين الجسمي Définition de la variation somaclonale

خلال مرحلة تشكل الكالوس، زراعة المعلقات الخلوية، أو زراعة البروتوبلاست لخلايا نباتية، يمكن أن تحدث تغيرات وراثية عشوائية لل Eric , 2003 ) ADN )، مصدرها غير معروف، والتغير غير اعتيادي، تسمی التباين الجسمي (1999 ,.El hamdouni et al). وهو مجموع التغيرات الوراثية المتحصل عليها بعد المرور بالظروف المخبرية، والتي تجدد إلى نبات مستقر خلوية (1989 ,Dubois). يستدل عليها بظهور نسخ غير مطابقة مرفولوجيا أو فيزيولوجيا للنبات الأصلي، هذه الأنماط الجديدة الظاهرة، تنوع بخصوصها الاصطلاح في التسمية، سميت المتباينات المظهرية «Phenovariant» أو Vitro variant من طرف Sibi (1971)، في حين استخدم Larkin و Scowcroft سنة (1981) مصطلح التباين الجسمي Variations somaclonale لأول مرة للإشارة إلى التباينات الجينية المتناقلة والمكتشفة في النسائل الجسمية “Somaclones”، والمحفزة عن طريق زراعة الأنسجة أو الخلايا مخبريا، تظهر أحيانا كأنها نمط ظاهري جديد في النباتات المتوالدة انطلاقا من الزراعة النسيجية (1989 ,Lepoivre et Semal).

4. 2 مبدأ التغيرات الجسمية Le principe de la variation somaclonale

يتشكل الكالوس خلال زراعة نسيجية، لقطع من النبات خالية من البراعم، في وسط مدعم بمنظمات النمو (1996 Dubois , 1989 ; Rousselle et al) ، ومن أي فسيلة من النبات كالورقة، الجذر، الساق، الأزهار، حبوب الطلع، البذور غير الناضجة، الفلقات (2005 , Eric , 2003 ; Richard ). يتم خلال تشكل الكالوس في الظروف المخبرية، احداث طفرات للرفع من مستوى التغير الوراثي، الناتج من التكاثر الخلوي العشوائي بعد فقدان التمايز للخلايا الأصلية (2002 ,.Nguyen et al).

4 . 3 أصل التباينات الجسمية Origine de la variation somaclonale

اقترحت عدة فرضيات حول أصل التباين الجسمي، فقد يكون مفرا مباشرة بشروط الزراعة النسيجية خاصة منظمات النمو، أو يحدث عفويا، وهو يعبر عن نفسه بصورة مستمرة عبر الأجيال ( Mestre et 1985 ,. Petiard)، أو قد يكون موجود مسبقا تحت شكل فسيفسائي في النبات (1985 ,Noseran).

يمكن للتباين الجسمي أن يكون:

وراثي النمط: مستقرا جينيا ويتناقل إلى الأجيال الموالية (1992 ,.Parrot et al)، يسمح بعزل طفرات مستقرة، تكتشف في الظروف المخبرية أو بعد تجديد النبات، يستعمل في برامج التحسين ( 2006 ,Kole).

ينتج التباين الجسمي وراثي النمط حسب (1999 ,.El hamdouni et al) عن:

تغير في العدد الصبغي.

حالة تعدد الصيغة الصبغية.
حالة غير عادية للصيغة الصبغية.

تغير في بنية الصبغي والذي قد يحدث بعدة آليات:

تقطيع الصبغي إلى جزئين بحصول کسر داخلي.
حذف قطعة وسطية من الصبغي.
تبادل قطع صبغية بين الصبغيات غير المتماثلة.
تأخذ فيها قطعة صبغية وضعية معاكسة مقارنة مع وضعها الأصلي داخل الصبغي.

تغير في عدد النيكليوتيدات
طفرات سيتوبلازمية

ظاهري النمط: وبائي غير مستقر و ينقرض بعد الإنتاج الجنسي (1994 ,.Skirvin et al)، وهذا بسبب الاضطراب الفيزيولوجي، ميثلة أو تضخيم المورثة ( 2006 ,Kole).

4 . 4 مراحل إنتاج التباينات الجسمية Les étapes de la variation somaclonale

تتمثل في تحريض إنتاج الكالوس ثم تجديد النبات، بوضع أجزاء نباتية في وسط زراعي يسمح بتشگل الكالوسات، وخلال هذا التجديد تحدث تعديلات كثيرة في النمط الوراثي والظاهري ( Sibi , 1989 ; Larkin et .(Scowcroft, 1981

4 . 5 أهمية التباينات الجسمية Interet de la variation somaclonale

يعتبر التباين الجسمي أهم مصادر التباين الجيني، والذي يترجم بظهور نسائل جسمية جديدة في النباتات المتوالدة وعلى نحو واسع (1981 ,Larkin et Scowcroft)، وهي مختلفة عن النبات الأصلي المنحدرة منه، قد تتضمن خصائص مهمة كمقاومة الملوحة ( 2002 ,Choi et al . , 2000 ; Farhatullah et Raziuddin)، إذن فهي مصدر للتنوع الذي يستعمل أحيانا في الانتقاء (1991 ,Bouharmont) .

عند البطاطس التباين الجسمي مهم لانتقاء كالوسات مقاومة للملوحة ;2007 ,.Ehsanpour et al) .lutts et Bouharmont, 2001)

4 . 6 العوامل المؤثرة على التباينات الجسمية Facteurs ayant une action sur la variation somaclonale

المادة النباتية: يمكن الحصول على التباين الجسمي انطلاقا من الكالوس المشكل، من أي جزء نباتي کالورقة، الساق، الجذر ..، لكن التأثير يكون من خلال طبيعة هذا الجزء، وحالته الفيزيولوجية ( Filippone et 1994 , al . , 1992 ; Robert et al). مرونة النمط الوراثي والنوع لهما دور مهم في ظهور التغير الوراثي (1989 ,Demarly et Sibi). العدد الصبغي ينعكس على معدل ونوعية التباين المنتج، حيث يلاحظ أن التباين الجيني يحدث بكثرة عند الأفراد متعددي الصيغة الصبغية مقارنة بذوي الصيغة الصبغية الأحادية والثنائية .(Yeoman, 1986)
مدة الزراعة النسيجية: تؤثر على التباين الجسمي، لأن معدل الطفرات مرتبط بعدد التحولات في الظروف المخبرية (1989 ,Demarly et Sibi)، حيث يتحكم عدد مرات النقل المخبري في عدد الطفرات الحاصلة Skiiin (1976 ,.et Janick)، والتي يمكن أن تظهر في الفترات الأولى في الزراعة النسيجية، وتثبت انطلاقا من التحويل الثالث أو الرابع (1989 ,Sibi).

إن عدد دورات الزراعة النسيجية من أهم العوامل الأساسية المحفزة للتباينات الجسمية، كما وجد في حالة البطاطس، حيث أن النمو البطيء يحفز إنتاج تباينات جسمية بكثرة (1994 ,.Wang et al).

تركيب الوسط: يعتبر عامل مهم في تشكيل التباينات الجسمية (1995 ,Angela)؛ كون إنتاج الكالوس مرتبط بالدرجة الأولى بميزان منظمات النمو، والذي يختلف حسب نوع الفسيلة والنوع المدروس ,.Andre et al) (2003، حيث تختلف البرامج المورفووراثية حسب النسبة Cytokinine / Auxine ، فمن خلال الميزان الهرموني يمكن الحصول على التشكل العضوي المرغوب (2004 , Akbar et Hakoomat)، إن عمل منظمات النمو بالضبط في إحداث التغيرات الجسمية يبقى غير معروف (1987 .Charlotte et al).

الاوكسين : أثبتت التجارب أن الأثر الأول للأوكسين هو التأثير على طبيعة الجدر الخلوية، لكن نظرا الوجود تأثيرات مميزة للأوكسين لا تتضمن حجم الخلايا، مثل تشجيعه لانقسام الخلايا وتشجيع نمو الجذور في التراكيز المنخفضة، أجمع الباحثون على أن تأثير الأوكسينات على جدر الخلايا هو في الواقع تأثير ثانوي (Sobhy, 2002)

ان الاوكسين المركب D-2 , 4 يزيد من عدد الطفرات عند العشب الأمريكي Tradescantia، كما يزيد من تغير الكرموزومات الأخوة في جذر الثوم Allium sativum، لكن معلومات قليلة حول تاثیر منضمات النمو على التباين الجسمي خلال مرحلة الزراعة النسيجية (1995 ,Angela). :

السيتوكينين:

أهم خصائص ووظائف السيتوكينين هو تأثيره على انقسام الخلايا.
تاخير دخول النسيج النباتي في الشيخوخة، إيقاف أو تأخير التحلل والموت، إيقاف التساقط ومنعه مثل تساقط الأوراق والأزهار والثمار.
يمنع الاصفرار لتأثيره الموجب على البروتين والاحتفاظ بمادة الكلوروفيل ومنع تحللها.
يجذب كثيرا من المواد والعناصر إلى مكان وجود الكينيتين أو الزينتين أوالبنزيل أدينين ومن هذه المواد الأيونات الغير العضوية وجزيئات عضوية مثل السكر والأحماض الأمينية وأيضا غالبية عصارة الخشب واللحاء فيتجه تيارها إلى البقعة التي بها السيتوكينين.
ومن التطبيقات الهامة للسيتوكينين هو تأثيرها على السيادة القمية فتؤدي المعاملة به إلى تشجيع تكوين البراعم الجانبية في (2002 ,Sobhy).

ويؤكد (1975 ,.Oluf et al) أن الكنتين وسيتوكينينات أخرى بتركيز 10 الى 10-5 مول/ل تساهم في تشكيل الأجزاء الهوائية في الأوراق و بین العقد لعدد كبير من النباتات ثنائية الفلقة.

الجبرلينات: يؤثر الجبرلين على جدر الخلايا بطريقة مختلفة عن الأوكسين، فالجبرلين يزيد من حجم الخلايا دون أن يؤثر على ص لابة الجدر الخلوية، أي يؤدي إلى زيادة حجم الخلايا ونسبة تدفق الماء اليها عن طريق زيادة تركيز المواد الذائبة الرافعة للضغط الأسموزی، وبهذا فالجبرلين يشجع نشاط إنزيم ألفا آمیلاز، والذي يحول كل من البروتينات والنشاء من الصور غير الذائبة أي غير النشطة اسموزيا إلى صورة ذائبة نشطة اسموزيا .(Sobhy, 2002)

الجدول 1: تراكيز منظمات النمو المستعملة لإنتاج الكالوس عند نبات البطاطس من طرف بعض الباحثين

الصنف المدروس	الفسيلة المستعملة	الوسط الزراعي	الميزان الهرموني			المرجع الباحث
الصنف المدروس	الفسيلة المستعملة	الوسط الزراعي	الأوكسين	السيتوكينين	GA3	المرجع الباحث
Cara A25/19	اجزاء هوائية قمم نامية	MS	3 . 2 مغ/ل IAA 0.5 مع ال D-2.4	0 . 1 مغ/ل کنتین	–	Ahloowalia 1982
Bintje	قطع من الورقة أقراص من الدرنة	MS	5مغ /ل من NAA, IAA 2,4-D	1 مغل BAP زیاتين + کنتین	0.1 – 1 مغ/ل	Charlotte et al., 1987
Ung-buay AIS 012222, Xu-shu 18, I-166. CN 1028-15	مرستیم ورقي قمة الساق	MS	2.5 مغ/ل من 2.4D	1.5مغ /ل الكنتين	0.1 مغ/ل	Anura et al.,1988
Désirée	ورقة	MS	5 مغ/ل من 2.4D	0.5 مغ /ل الكنتين	–	Sabbah et al., 1990
Kennebec	–	MS	10.7 u مول/ل من NAA	0.45 u مول/ل من کنتین	–	Ochatt1 et al., 1999
Maris Bard Désiré	ورقة جذر ساق درنة	MS	5 مغ /ل من NAA 0 . 1مغ/ل NAA 3 مغ/ل من 2-4 D	0.5 مغ/ل کنتین 5 مغ/ ل زياتين 0.5 مغل کنتین	–	Hakan, 2004
Désirée	أوراق	MS	1-0.2-0.5 مغ/دسم3 Mg dm-3 IAA – NAA – BA	1 مغ/دسم3 كنتين 0.4 مغ/دسم3 زياتين	0.5 مغ/دسم3	Queiros et ,.al 2007
Diamant	قطع من الدرنات	MS	(0.5،1،1.5،2،3،4 و5 مغ/ل ) 2-4 D -BA- NAA	(0.5،1،1.5،2،3،4 و5 مغ/ل ) BAP	–	Khadiga et al., 2009

العناصر المغذية: تستطيع العناصر المغذية مثل الأملاح، السكريات، وكذا بعض المواد المستعملة للتعقيم ضد الفيروسات، أن تكون سببا في التشكل غير الطبيعي للنبات (1984 ,Meulmans).
– العامل المسبب للإجهاد: بينت نتائج سابقة أن تشكل التغيرات الجسمية، يمكن أن يتأثر بوجود العامل المسبب للإجهاد أثناء فترة تكاثر الخلايا خلال الزراعة النسيجية (2001 ,.Lutts et al). حيث يتم في أعمال كثيرة تعريض الكالوس إلى تركيز ملحي مثبط في وسط مغذي، وأي خلايا تبقى حية، وتنقسم تحت هذه الظروف، تكون مرشحة لدراسات أخرى لانتقاء أنماط متحملة للملوحة (1991 ,.Jain et al)، إلا أنه لا توجد أية معلومات بخصوص تأثير الملح NaCl على المادة الوراثية المكونة للتغيرات الجسمية وخصوصيتها ( Lutts et .al., 2001).

4. 7 تقييم التغيرات الجسمية Evaluation de la variation somaclonale

مع تطور تقنية (Polymerase Chain Reaction ( PCR ، أصبح من الممكن دراسة التغيرات الوراثية عند النبات بفضل البصمة والخريطة الوراثيتين لل Sultana et al . , 2005 ) DNA ). تعتمد تقنية PCR على استعمال (Random Amplified Polymorphic DNA ( RAPD أو RFLP ( Restriction Fragment (Length Polymorphism وهي مهمة في دراسة عناصر مقاومة الملوحة (1999 ,Subbarao et Chris) عند البطاطس (2007 ,.Ehsanpour et al).

4. 8 ايجابيات التباين الجسمي Les avantages de la variation somaclonale

الحصول السريع على عدد كبير من الطفرات (أفراد تظهر تغيرات وراثية مقارنة بالنبات الأم).
إمكانية الحصول على عدة خصائص مختلفة مفيدة في آن واحد.
مصدر للتنوع الذي يستعمل أحيانا في الانتقاء
طريقة جديدة لتحسين النباتات.
غير مكلفة مقارنة بالتهجين الجسمي والتحويل الوراثي.
ليس مهم معرفة اسس التغير الحاصلة وراثيا .

4.9 سلبيات التباين الجسمي Les inconvinients de la variation somaclonale

غياب المراقبة على الكمية، المكان وأهمية الطفرات الحاصلة، والعوامل المؤثرة عليها. ،
ظهور تغيرات غير متوقعة.
ضعف استقرار الخصائص المحصل عليها، والتي تختفي عند النبات المجدد البالغ أو الأجيال اللاحقة.
الحصول على نباتات بالصفات المرغوبة غير مضمون.
بينت الدراسات الأولى حول الزراعة النسيجية للبطاطس أن الجينوم غير مستقر خلال تشكل الكالوس والزراعة الجزئية (1994 ,Robert).
عند عدد من النباتات المحسنة، يعتبر تحلیل ومراقبة التباينات الجسمية مهم جدا، وهو في نفس الوقت امر صعب (1995 ,Masayoshi et al . , 1996 ; Eric , 2003 ; Angela ).